鸭源致病性大肠杆菌的分离与药敏试验

季峥嵘

摘要：对安徽省鸭场病死鸭的脑、肝脏、和脾脏和心脏进行分离培养，经革兰氏染色、生化试验、菌落研究，初步鉴定为大肠杆菌。在致病性试验中，以3.0×108 CFU/mL剂量感染健康昆明小鼠，小白鼠在8～24 h内全部死亡。药物敏感试验结果显示该鸭分离的菌株对链霉素、氯霉素、磺胺异恶唑、青霉素、红霉素、呋喃妥因、四环素、阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、阿莫西林、恩诺沙星、氟苯尼考和强力霉素已经产生了很强的耐药性,为提高临床合理用药提供科学依据。

关键词：鸭大肠杆菌；分离鉴定；药敏试验

Abstract:Duck duck farming in Hubei province died of brain, liver, and spleen and heart were isolated and cultured by Gram staining, biochemical testing, colonies of initially identified as E. coli. In pathogenicity tests to infect healthy dose of 3.0 × 108 CFU/mL mouse, mice in all died within 8～24 h. Drug sensitivity tests revealed that the duck isolates to streptomycin, chloramphenicol, sulfonamides isoxazole, penicillin, erythromycin, nitrofurantoin, tetracycline, amikacin, gentamicin, kanamycin, A amoxicillin, enrofloxacin, florfenicol and doxycycline have produced a very strong resistance, to improve the scientific basis for rational clinical use of the drug.

Key words: duck E.coli; isolation; susceptibility test

近年来，随着我国养禽业的迅速发展，家禽饲养密度不断增加，集约化程度不断提高，引种、异地贩运日益频繁，大肠杆菌的交叉污染，给养禽业带了了严重的经济损失，是禽病调查中最常见报道的疾病及胴体废弃的主要原因。只有在研究清楚该菌的特征后才能更好的对症治疗和防治此病,对发病的鸭子进行用药，先通过药敏试验，选择合理的药物进行治疗，交叉用药(以防耐药)，降低经济损失。运用科学的诊断方法科学的管理手段，降低饲养成本，了解其特征，对症治疗，有效保障鸭殖业健康的发展，促进农民增收。

1材料和方法

1.1试验材料

1.1.1病料及主要试剂[1]

病料，安徽某鸭场病死亡鸭肝脏、心脏和脑；小白鼠，购自湖北省实验动物研究中心；麦康凯琼脂，普通肉汤自配，TSA（Tryptic Soy Agar）胰酶大豆琼脂培养基购自BD公司；生化试验微量发酵管和药敏试纸均购于杭州微生物试剂有限公司。

1.1.2仪器设备

电热恒温鼓风干燥箱、培养箱、电子天平、灭菌锅、冷藏冰箱、超净工作台、生物显微镜。

1.2方法

1.2.1 制作培养基

麦康凯琼脂培养基[2]、普通肉汤培养基[2]、TSA培养基[3]。

1.2.2分离病原菌

无菌取病死鸭脑、肝脏和心脏组织，直接划线接种于麦康凯和TSA平板，37℃恒温箱中培养18～24 h，观察结果。

1.2.3革兰氏染色

先用灭种环取少量生理盐水滴在玻片中央，然后再用接种环取少量病原菌，在液滴种混合，均匀涂抹成薄层，并让其自然干燥。将干燥好的涂菌面朝上，使其背面在酒精灯的火上来回烤几次，以达到杀菌固定的目的。

染色步骤如下：

（1）草酸铵结晶紫染色液，初染1 min，水洗，甩干；

（2）加革兰碘液页抹片上，媒染1 min，水洗，甩干；

（3）95%酒精于抹片上脱色5～10 s，水洗，甩干；

（4）沙黄溶液复染1 min，水洗 ，吸干。

用普通显微镜观察，接通电源，先用高倍镜观察找到细菌的区域，然后在玻片上滴一滴香柏油，转至油镜进行观察。观察完后用二甲苯洗镜头，擦拭干净，拔掉插头，罩上防尘罩。

1.2.4纯化病原菌

从麦康凯琼脂培养基上挑选红色、圆形凸起、表面光滑的单个菌落划线于新的麦康凯琼脂平板，在37℃恒温培养箱中培养18～24 h，观察结果再次染色、镜检。若菌体形态和染色形态符合大肠杆菌的形态和染色特征时，挑选剩余半个菌落接种麦康凯斜面培养基上，37℃恒温箱中培养18～24 h，然后置4℃冰箱中保存备用。

1.2.5 生化试验

将菌株接种液体培养基，37℃恒温箱中培养24 h后用接种针接种到葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、山梨醇、木糖、棉子糖、肌醇、亚硝酸盐、水杨素、卫矛醇、侧金盏花醇、阿拉伯糖、蛋白胨、硫化氢、鼠李糖和尿素微量发酵管，放在37℃培养箱中培养24 h后生化反应结果。

1.2.6药敏试验

以1999年美国临床实验室标准华委员会（NCCLS）下设的纸片扩散法敏感试验分委员会推荐的标准方法，Kirby-Bauer（K-B）方法进行。将菌株接种到液体培养基中，在37℃恒温箱中培养18～24 h，在无菌操作台里，用灭菌生理盐水稀释至其浊度相当于0.5号麦氏标准，即肉汤中细菌数约为1×108 CFU/mL。用无菌棉签吸取调好浓度的菌液,在营养琼脂平板表面均匀涂 ,在琼脂平板上贴加抗菌药纸片：用灭菌尖头镊子夹取链霉素、氯霉素、磺胺异恶唑、青霉素、红霉素、呋喃妥因、四环素、阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、阿莫西林、恩诺沙星、头孢肤肟、氟苯尼考、强力霉素多粘菌素B和环丙沙星的抗菌药药敏试纸片，按一定的密度分别贴在上述已涂满细菌的平板表面，用镊子轻压，确保药敏试纸与琼脂面充分接触。纸片贴完15 min，后将平板翻转过来，放到37℃恒温培养箱中培养18～24 h，取出观察[4]。

1.2.7 致病性试验

小白鼠致病性实验：取已经分离纯化的病原菌用接种环接种到液体培养基中，培养18～24 h，用灭菌生理盐水稀释其浓度为1.5号麦氏标准，即肉汤中细菌数约为3×108 CFU/mL，用1 mL的注射器对18～25 g小白鼠进行腹腔接种，0.3 mL/只，接种8只；对参照组经相同途径接种0.3 mL的灭菌生理盐水，接种2只。接种后饲养观察，记录小白鼠死亡时间并从死亡小白鼠的肝脏、心脏分离致病菌[5]。

2 结果与分析

2.1 临床症状及剖解特征

自然感染鸭大肠杆菌的病鸭表现为:精神沉郁，喜卧，不愿走动, 食欲下降, 排黄绿色粪便。剖检可见纤维性心包炎、肝炎、气囊炎、脑炎特征。腹膜炎严重，卵巢上卵泡变性，输卵管粘膜出血，水肿平伴有干酪样凝乳块沉积。图1 为自然感染鸭大肠杆菌病鸭的解剖照片，图中可见典型的纤维素性肝周炎、心包炎、气囊炎病理变化[6]。

2.2 致病菌的特征

经培养需分离的病原菌在麦康凯琼脂平板上形成圆形、光滑湿润、边缘整齐的中等大菌落, 菌落边缘整齐, 打开后具有特殊的粪便样臭味，稍有凸起，表面光滑湿润，直径1.5～2 mm，呈红色或粉红色；在普通琼脂斜面上为灰白色菌落；在普通肉汤中呈均匀混浊, 管底有灰白色沉淀,轻摇试管, 沉淀缓缓上升；在TSA培养基上形成圆形、光滑湿润、边缘整齐的白色菌落[7]。经革兰氏染色观察到细菌呈杆状，两端钝圆，菌体为粉红色，故此菌为革兰氏阴性菌，符合大肠杆菌的形态和染色特征时。