烧伤后大鼠不同骨骼肌凋亡相关蛋白的转录表达变化

吴焱秋 柴家科 张海龙 耿祎楠

[摘要]目的：通过检测烧伤大鼠不同骨骼肌组织中凋亡相关蛋白的转录变化，探讨细胞凋亡对烧伤后骨骼肌高消耗的影响机制。方法：180只大鼠随机分为5组，通过建立大鼠烧伤模型，分别在烧伤后6h、1天、3天、7天及14天切取大鼠伸趾长肌和比目鱼肌，采用RT-PCR方法测定骨骼肌组织Akt、Bcl-2、Caspase-3的转录表达。结果：伸趾长肌Akt转录表达在伤后前期变化不明显，在第14天显著下降；Bcl-2转录表达在初期轻度上升，在后期下降；Caspase-3转录表达在伤后第7天和第14天显著增高。比目鱼肌Akt转录表达在烧伤后6h、1天、4天、7天无明显变化，在烧伤后14天显著下降；Bcl-2转录表达在烧伤后6h、1天和4天呈逐渐表达显著增强趋势，而后逐渐下降，；Caspase-3转录表达各个时间点无显著变化。结论：在严重烧伤大鼠，快白肌组织凋亡明显，而且随着病程的延长，凋亡越显著；慢红肌组织凋亡不明显，尽管随着病程的延续，有上升的趋势。

[关键词]烧伤；骨骼肌；凋亡

[中图分类号]Q591.2[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2014）08-0633-03

The transcriptional changes in apoptosis-related proteins in different types of skeletal muscle in burned rats

WU Yan-qiu,CHAI Jia-ke，ZHANG Hai-long，GENG Yi-nan

(Burns Institute,The First Affiliated Hospital to the General Hospital of PLA, Beijing 100048, China)

Abstract:ObjectiveBy detecting the transcriptional changes in apoptosis-related proteins in different types of skeletal muscle in burned rats, the influence mechanism of apoptosis on the skeletal muscle wasting was studied.Methods180 rats were randomly divided into 5 groups. By setting up the rat burned model, extensor digital longus muscle and soleus muscle samples were collected at 6h,1d,4d,7d and 14d after burn injury. Transcriptal expression of Ake, Bcl-2 and caspase-3 were measured by RT-PCR method. Results In extensor digital longus muscle, the Akt expression decreased significantly at different time points. The Bcl-2 expression increased slightly at early stage,but decreased at late stage.Caspase-3 expression increased significantly on days 7 and 14 postburn. While in soleus muscle,there were no significant changes in Akt expression at other time points except significant decrease on day 14. There were significant increases in Bcl-2 at 6h,1d and 4d, and the decrease gradually on days 7 and 14 postburn. There were no marked changes in caspase-3 expression. Conclusion In severely burned rats, apoptosis could commonly occur in fast-white skeletal muscle,and become markedly along with the prolongation of the disease course, with no obvious change in slow-red skeletal muscle.

Key words: burn injury; skeletal muscle;apoptosis大面积深度烧伤对全身的影响极为剧烈，骨骼肌作为人体最大的含氮组织，在严重烧伤时会发生明显萎缩，因此是烧伤时机体蛋白质丧失的主要来源[1]。骨骼肌蛋白大量丢失危害甚大，因此，弄清烧伤时骨骼肌萎缩的机制，并采取有效措施进行干预或调控，对纠正烧伤代谢紊乱，提高患者生存率，具有重要指导意义[2]。本研究采用大鼠烧伤模型，测定骨骼肌组织中凋亡相关成分的表达变化，为临床干预或调控骨骼肌萎缩和肌肉蛋白高消耗提供新的依据。

1材料和方法

1.1 实验动物：雄性Wistar大鼠180只，由中国军事医学科学院动物中心提供，体重60～70g，动物购进后本单位动物实验室饲养性喂养一周以上。

1.2 试剂：GoldViewTM核酸染料（赛百盛公司）；总RNA提取试剂盒（美国Life Technology公司）；AMV反转录试剂盒（美国Promega公司）；Taq DNA聚合酶（美国Promega公司）；PCR Marker（赛百盛公司）；dNTPs（美国Promega公司）；TAE电泳缓冲液（北京鼎国公司）；琼脂糖（美国Promega公司）；溴酚蓝（美国Sigma公司）；二甲苯青FF（美国Sigma公司）焦碳酸二乙酯（美国Promega公司）；TAE电泳缓冲液。

相关引物序列（北京赛百盛生物工程技术公司提供）：

大鼠Akt：扩增长度720bp

5'--ACA,GAC,GGC,TCA,TTC,ATA,GG-3'，5'--CTC,GGT,ACA,CAA,TCT,TTC,CAG-3';

大鼠Bcl-2：扩增长度481bp

5'--TCG,TGA,TGA,AGT,ACA,TCC-3'，

5'--CAT,CCA,CAG,AGC,GAT,GTT-3'；

大鼠Caspase-3：扩增长度655bp

5'--CCT,ATT,CAC,ACA,CAC,ACT,CC-3'，

5'--CAT,CCC,ATC,TCT,TTC,TTT,CC-3';

大鼠三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)：扩增长度309bp[3]

5'--TCC,CTC,AAG,ATT,GTC,AGC,AA-3'，

5'--AGA,TCC,ACA,ACG,GAT,ACA,TT-3'。1.3 制作烧伤动物模型：试验前12h禁食，自由饮水。复方氯胺酮（0.1mg/kg）腹腔注射麻醉，脱毛器背部体侧脱毛。麻醉满意后，100℃沸水持续12s，造成大鼠背部30%Ⅲ度烫伤（以下简称烧伤），烧伤深度经病理证实。立即腹腔注射生理盐水40ml/kg复苏。将大鼠置于代谢笼观察。

1.4 动物分组：随机分成5组，分别为处理后6h、1天、3天、7天及14天组，每个时间点设正常对照12只，烧伤大鼠每个时间点24只，活杀取材。

1.5 标本采集及处理：严格无菌、无创游离大鼠伸趾长肌和比目鱼肌，新鲜标本分别进行骨骼肌充氧离体孵育、液氮保存和4%多聚甲醛固定。孵育液体-70℃冰箱保存。

1.6观察指标：本研究采用RT-PCR方法测定骨骼肌组织Akt、Bcl-2、Caspase-3转录水平的表达变化。三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为稳定表达的看家基因，被选择作用内参，以目的基因与内参对照表达间的比值反映目的基因表达的相对含量。结果采用Alpha Innotech Corporation公司的Alpha Easy FC软件进行图像分析。

1.7统计学处理：所有数据均以x±s表示，统计学处理采用SPSS12.0软件进行t检验、方差分析，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异非常显著。

2结果

2.1 大鼠烧伤后伸趾长肌组织中Akt转录表达在正常对照组即有高表达，烧伤后6h略有下降，烧伤后1天表达显著下降，烧伤后4天出现回升，7和14天变化不明显，整体趋势呈显著下降，除6h组外，其他组和正常对照相比下降显著(图1)。

2.2 烧伤后伸趾长肌组织中的Bcl-2转录表达在正常对照组可见表达，烧伤后6h轻度升高，烧伤后1天变化不明显，烧伤后4天表达显著升高，7和14天略有下降，但与正常对照相比仍显著增加（图2）。

2.3 烧伤后伸趾长肌组织中的Caspase-3转录表达在正常对照组轻度表达，6h、1天、4天轻度升高，7和14天显著升高，基本上呈逐渐上升趋势（图3）。

2.4 烧伤后比目鱼肌组织中Akt转录表达在正常对照组轻度表达，烧伤后6h、1天、4天、7天与正常对照组相比变化不明显，在烧伤后14天下降明显，与正常对照组相比下降有显著差异（图4）。

2.5 烧伤后比目鱼肌组织中Bcl-2转录表达在正常对照组轻度表达，而后在烧伤后6h、1天和4天组呈逐渐表达显著增强趋势，而后逐渐下降，至烧伤后14天下降到低谷，各组相比差异不显著（图5）。

2.6 烧伤后比目鱼肌组织中Caspase-3转录表达在正常对照组轻度表达，在烧伤后6h、1天、4天、7天和14天各个时间点无显著变化（图6）。

3讨论

临床上关于烧伤的代谢和营养问题一直贯穿其治疗过程的始终。骨骼肌含有机体蛋白总干重的55%～60%，是机体最大的含氮库。在烧伤时，骨骼肌组织发生显著的消耗和萎缩，导致机体不仅出现严重的低蛋白血症，而且伴有严重的负氮平衡。这些变化非常不利于患者创面的愈合，患者抵御感染的能力也明显下降，结果进一步加重患者的病情，因此阐明烧伤时骨骼肌消耗和萎缩的机制具有重要的临床意义。国外已有研究表明[4]，在生物体发育过程中，存在肌肉凋亡现象，导致收缩功能的丧失。但有关烧伤时骨骼肌细胞消耗和凋亡之间的关系仍需进一步研究。

本研究结果显示，在烧伤刺激后，伸趾长肌组织中Akt转录表达在正常对照组即有高表达，整体趋势呈显著下降，而且与对照组相比有显著差异。由于Akt参与抗凋亡作用，它的表达降低表明烧伤后伸趾长肌组织抗凋亡作用减弱，其结果可能导致肌肉凋亡的增强。

Bcl-2表达在烧伤后6h轻度升高，说明机体抗凋亡作用轻度降低，在烧伤后4天出现显著升高，可能主要由于应激的刺激，机体反应性增加抗凋亡作用[5]。但在烧伤后7和14天组又出现下降趋势，且伤后14天组较正常对照组显著降低，表明烧伤早期机体可能对伸趾长肌组织蛋白降解具有抵抗作用，为了保证肌肉组织的完整性，防止肌肉细胞发生凋亡；但是随着时间的延长，可能还有烧伤创面的感染，无法继续防止肌肉萎缩的发生，结果任其消耗。

烧伤后伸趾长肌组织中Caspase 3转录表达变化呈现持续上升趋势。由于caspase 3是参与凋亡的主要效应酶，其升高表明组织凋亡比较活跃[6]，早期可能由于机体抗凋亡信号比较活跃，表达不是很高；后期由于抗凋亡系统逐渐衰弱，促进凋亡的信号增强，从而在烧伤后期高表达，刺激伸趾长肌组织发生凋亡，进而促进肌肉组织的消耗和萎缩。

比目鱼肌属于慢红肌纤维，在烧伤大鼠比目鱼肌组织中，Akt转录表达早期无明显变化，但在伤后14天组下降明显。说明随着烧伤时间延长，慢红肌纤维也出现抗凋亡作用减弱。其Bcl-2的转录表达基本和Akt表达相似，但是降低时间较Akt提前，表明比目鱼肌组织早期均有抵抗肌肉萎缩和消耗的作用，在烧伤后期均出现抗凋亡作用乏力。其caspase 3的转录表达没有发生显著的变化，但在烧伤后期有逐渐上升的趋势，表明在烧伤大鼠比目鱼肌组织中发生凋亡的可能性明显增大。

根据上述研究，可以推断，在严重烧伤大鼠，快白肌组织凋亡明显，而且随着病程的延长，凋亡越显著；慢红肌组织凋亡不明显，尽管随着病程的延续，有上升的趋势。

[参考文献]

[1]盛志勇,郭振荣.危重烧伤治疗与康复学[M].北京:科学出版社,2000:320-322.

[2]柴家科.严重烧伤后骨骼肌消耗的机制与治疗前景思考[J].中华烧伤杂志,2009,25(4):243-245.

[3]Thompson MG,Thom A,Partridge K,et al.Stimulation of myofibrillar protein degradation and expression of mRNA encoding the ubiquitin-proteasome system in C(2)C(12) myotubes by dexamethasone:effect of the proteasome inhibitor MG-132 [J].J Cell Physiol,1999,181(3):455-461.

[4]Friehs I,Barillas R,Vasilyev NV,et al.Vascular endothelial growth factor prevents apoptosis and preserves contractile function in hypertrophied infant heart[J]. Circulation,2006,114(1 Suppl):1290-1295.

[5]姜疆,刘毅,蔡黔,等.高原不同海拔地区大鼠严重烫伤延迟复苏后肾组织细胞凋亡及Bcl-2蛋白的表达[J]. 解放军医学杂志,2008,33(9):1062-1065.

[6]Siu PM,Tam EW,Teng BT,et al.Muscle apoptosis is induced in pressure-induced deep tissue injury[J].J Appl Physiol,2009,107(4):1266-1275.

[收稿日期]2010-11-23[修回日期]2014-04-11

编辑/张惠娟