LC—MS/MS法测定人血浆中盐酸马尼地平及药动学研究

李杰　邵凤　许杨　陶春蕾　周燕　宋欣

摘 要 建立人血浆中盐酸马尼地平浓度测定的LC/MS/MS法，进行人体药动学研究。方法： 通过24名健康志愿者口服受试制剂，采用单次空腹（20 mg（20 mg/片））和高脂餐后（20 mg（20 mg/片））两周期双交叉试验及单次空腹10 mg（10 mg/片）和连续多次给药10 mg（10 mg/片）试验设计，测定人血浆中盐酸马尼地平的浓度。结果： 主要药动学参数分别为：单次空腹口服10 mg，20 mg盐酸马尼地平后：Cmax3.52？.023 ng·mL-1，Tmax1.264？.372 h，AUC0-36h13.399？.451 ng/ml·h； Cmax5.59？.863 ng·mL-1，Tmax1.417？.359h， AUC0-36h23.697？0.179 ng/ml·h；单次餐后口服20 mg盐酸马尼地平后：Cmax9.307？.288 ng·mL-1， Tmax2.292？.782h， AUC0-36h39.674？.362 ng/ml·h；连续多次给药10 mg盐酸马尼地平后Cmax3.454？.316 ng·mL-1，Tmax1.288？.38 h， AUC0-36h16.427？.554 ng/ml·h。结论： 本方法灵敏度高，结果准确，盐酸马尼地平在大部分人体内的过程符合二室开放模型，从而指导临床合理用药。

关键词 盐酸马尼地平 药代动力学 LC-MS/MS

中图分类号：R9 文献标识码：A

盐酸马尼地平（Hydrochloride Manidipine）是新一代二氢吡啶类钙离子双通道拮抗剂[1]，具有高度的血管选择性，对心脏作用很小。因此是一种强效、长效并能稳定降低血压药物。但由于盐酸马尼地平给药量小且性质不稳定，所以常规的方法[2]不能满足其在人体药代动力学的研究要求。本实验建立LC/MS/MS法，以地西泮为内标，能够更有效的测定人体血浆中盐酸马尼地平的药代动力学参数，为临床合理用药提供依据。

1材料与方法

1.1试剂与仪器

Agilent 1100 高效液相色谱仪；API 3000型质谱仪（AB公司）；CTC ANALYTIC型自动进样器； GL-16G-Ⅱ型高速冷冻离心机、TDL82-2B型低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；SZ-1型快速混匀器（江苏金坛市金成国胜实验仪器厂）；BF-2000氮气吹干仪（北京八方世纪科技有限公司）；AB135-S型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；GZX-9140MBE 数显鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司）；工作站：Analyst 1.5等。甲醇、乙腈均为色谱纯 （德国默克集团公司）；乙酸铵、乙酸均为分析纯（天津市光复精细化工研究所）；乙酸乙酯、正己烷、氢氧化钠均为分析纯（上海苏懿化学试剂有限公司）；娃哈哈水（杭州哇哈哈集团有限公司）。

1.2 试验药物

盐酸马尼地平片Ⅰ，规格：10mg/片，批号：130304，有效期：36个月；盐酸马尼地平片Ⅱ，规格：20mg/片，批号：130305，有效期：36个月，由济南利民制药有限责任公司生产提供。盐酸马尼地平对照品，批号：110307，含量为：99.7%，由济南利民制药有限责任公司提供。地西泮对照品，批号：171225-200903，含量为：99.9%，购买自中国食品药品检验所。

1.3药代动力学试验设计

1.3.1伦理学

根据赫尔辛基宣言、国际协调会议（ICH）的GCP原则、中华人民共和国国家食品药品监督管理局（SFDA）颁布的GCP原则和中华人民共和国药品管理法。在试验开始之前，研究人员向志愿受试者详细说明了试验药物的性质，试验的目的、方法，试验的风险和自愿参加的原则，并获得所有志愿受试者的知情同意书。

1.3.2试验对象

试验入选受试者体重45-72kg，平均体重55.71？.82kg；年龄20-25岁，平均年龄23.00？.25岁；男性受试者体重52-72kg，平均体重61.58？.99kg，年龄20-25岁，平均年龄23？.48岁；女性受试者体重45-58kg，平均体重49.83？.06kg，年龄21-24岁，平均年龄23？.04岁；男女体重指数均值19-24之间。

1.3.3试验设计

单次给药及食物影响试验：采用单次空腹给药和高脂餐后两周期双交叉试验设计（交叉的目的是消除个体差异），将12名健康受试者（6男、6女）随机分配至2 组，每位受试者第一周期分别空腹服用1片受试制剂盐酸马尼地平片Ⅱ（20mg/片）或高脂餐后服用1片受试制剂盐酸马尼地平片Ⅱ（20mg/片），按单剂给药。试验周期之间的清洗间隔为1周（清洗的目的是：药物一般经过5-7个半衰期消除，清洗1星期是确保消除每个给药周期的药物体内蓄积）。单次给药以及连续给药试验设计：招募12 名健康受试者，男女各半，受试者于试验前 10 小时入住 I 期临床监护病房，每位受试者首先分别空腹单次口服1 片受试制剂盐酸马尼地平片Ⅰ（10mg/ 片），给药两天后按照下面采血点进行采血分析（即为单次空腹口服10mg/ 片），同一批受试者在单次空腹口服试验制剂（10mg/ 片）后第 3 日晨每位受试者分别空腹口服试验用1 片盐酸马尼地平片Ⅰ（10mg/ 片，1 片/ 次，1 次/ 日），连续在每天早上同一时间空腹服药7 天，在第 6 、7、8 天每日服药前采血一次（测定谷浓度），并于第 9 日给药前经前臂静脉留置针穿刺术，采集同一时间谷浓度血样后服药，且服药后血样采集均与单次给药试验时间点相同。

1.3.4生物样品采集

单次给药及食物影响交叉试验采血点设计：于给药前0h 及给药后0.33（20min） 、0.67（40min） 、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0 、12.0 、24.0 和36h 采集静脉血，每一阶段总计采集15 个点。服药前1 小时内采集药前血样（0h）。连续给药采血点设计要求与连续给药试验设计要求一样，也是每个阶段采集15个点。

1.3.5 血液样品的处理及保存

每个血样都应放置于预先标记好的肝素化试管中于3500 rpm离心5 分钟，分离出的血浆在低于-20 ℃冷冻保存。从运输到样品被分析时都应在低于- 20 ℃保存。

1.3.6饮食要求

志愿受试者按照事先规定的时间进行饮水，服药和进食；餐后试验，从开始进高脂餐计时 30min 后服药； 志愿受试者在试验期间，至少从服药前48h到最后一次采血前，禁服任何含酒精和黄嘌呤的食品和饮料。

1.3.7安全性评价

试验后进行全面体格检查（其中包括心电图、血常规、尿常规、肾功能、肝功能等），各志愿者检查结果未见异常，有个别生化检查指标超出正常值范围，经判断无临床意义。连续多次给药试验过程中入选号为13号受试者因个人原因退出试验，剩余23例受试者全部完成试验。

1.3.8 数据处理

采用DAS2.1.1数据统计软件对血药浓度时间数据进行处理，计算有关的药代动力学参数。其中，达峰时间（Tmax）及峰浓度（Cmax）为实测值，药-时曲线下面积（AUC）采用梯形法计算。半衰期（t l/ 2）按末端相血药浓度对数值和时间进行线性回归，求得斜率（Ke） 法计算。药动学参数显著性差异比较采用SPSS19.0软件。

1.4 样本测定及方法学考察

1.4.1 血浆样品处理

精密量取200%eL血浆，精密加入20%eL内标地西泮对照溶液（100ng/mL），涡旋30s，加入100%eL氢氧化钠（1mol/L）涡旋1min，加入4mL提取剂（正己烷：乙酸乙酯=2：1）震荡涡旋3min，3000rpm离心10min ，取上清3.2mL，40℃氮气吹干后，加入400%eL甲醇复溶，涡旋1min再取出置于1.5mL离心管中，12000rpm离心10min，取上清液20%eL进样分析。

1.4.2 色谱、质谱条件

色谱条件：色谱柱：ZORBAX RX-C8 4.6？50 mm，5%em（Agilent）；流动相： 5mM乙酸铵（含0.1%乙酸）：甲醇：乙腈=15：40：45，流速：0.6 mL/min；柱温：40℃；样品盘温度：4℃；进样量：20%eL。质谱条件：离子源：ESI；离子检测方式：多反应监测（MRM）；离子极性：正离子；喷雾电压（Ionspray Voltage）：5500V；温度（Temperature）：550℃；雾化气（NEB）：12psi；气帘气（CUR）：12psi；碰撞诱导解离（CAD）：10psi；用于定量的离子分别为马尼地平[M+H]+m/z：611.5/166.7，锥孔电压（DP）：30V，碰撞能（CE）：30V；内标地西泮[M+H]+m/z：285.1/154.0，DP：30，CE：30；扫描时间为0.15s。

1.4.3 血清中马尼地平标准曲线

取马尼地平储备液，加空白血浆，按逐级稀释的方法依次配制成相当于马尼地平血浆浓度为0.1、0.2、0.4、1、2、5、10、15 ng·mL-1的样品，按“血浆样品处理” 项下依法操作，进样20 %eL。得到 y=0.184x-0.0018，r=0.9974，根据标准曲线，马尼地平的线性范围为0.1 ng·mL-1～15 ng·mL-1，定量下限为0.1 ng·mL-1（S/N>10）。

1.4.4 精密度和准确度试验

取空白血浆，按“血浆中马尼地平标准曲线和定量下限”项下的方法配制马尼地平低、中、高三个浓度（0.25，2.5和12 ng·mL-1）的质量控制（QC）样品，每一浓度进行6样本分析，连续测定三天，根据当日的标准曲线，计算QC样品的测得浓度。根据QC样品结果计算本法的精密度，结果低、中、高浓度第一天日内的RSD分别为5.318%、3.290%、1.001%、第二天日内的RSD分别为6.959%、2.177%、3.641%，第三天日内的RSD分别为13.456%、3.998%、4.210%，低、中、高浓度日间的RSD分别为10.328%、5.461%、5.498%。结果表明，日内、日间相对标准差（RSD%）<15%。

1.4.5 回收率和基质效应的测定

分别精密加入马尼地平浓度为（2.5，25和120 ng·mL-1）的低、中、高对照液各20%eL，40℃氮气吹干，加入空白血浆200%eL，配制成马尼地平血药浓度为（0.25，2.5和12 ng·mL-1）的低、中、高三个浓度的质量控制（QC）血浆样品，按“血浆样品处理方法” 项下自“精密加入20%eL内标地西泮对照溶液（100 ng·mL-1）”依法操作，得到马尼地平和内标地西泮的峰面积值AMAN和ADIA；精密量取200%eL空白血浆，加入100%eL氢氧化钠（1mol·L-1），涡旋1min后，加入4mL提取剂（正己烷：乙酸乙酯=2：1），震荡涡旋3min，3000rpm离心10min，取上清液3.2mL于试管中，分别精密加入马尼地平浓度为（2.5，25和120 ng·mL-1）的低、中、高对照液和内标地西泮对照溶液（100 ng·mL-1）各20%eL于试管中混匀，40℃氮气吹干后，加入400%eL甲醇复溶，涡旋1min后，取出置于1.5mL离心管中12000rpm离心5min后，取上清液20%eL进样分析。得到马尼地平和内标地西泮的峰面积值BMAN和BDIA；分别精密量取马尼地平浓度为（2.5，25和120 ng·mL-1）的低、中、高对照液和内标地西泮对照溶液（100 ng·mL-1）各20%eL于试管中，40℃氮气吹干，加入360%eL甲醇混匀后，取上清液20%eL进样分析，得到马尼地平和内标地西泮的峰面积值CMAN和CDIA；按下式计算：提取回收率（%）=A/B？00%，基质效应（%）=B/C？00%，结果，马尼地平的提取回收率为77.54%～83.80%，内标地西泮的平均提取回收率为78.82%。马尼地平的基质效应范围为75.83%～76.70%，内标地西泮的平均基质效应为78.66%。

1.4.6 稳定性实验

取低、中、高三个浓度（0.25，2.5和12 ng·mL-1）的血浆样品按不同要求操作；分别考察血浆样品按“血浆样品处理”项下操作后，待测样品室温放置8h，10h，20h稳定性（目的：在不同时间间隔取样，进行分析测定，测定结果与0h测定值进行比较稳定性）及血浆样品在-20℃冰箱中反复冻融三次和冷冻条件下放置29天的稳定性，结果见表1。结果显示马尼地平按“血浆样品处理”项下操作室温放置20h，-20℃冰箱中反复冻融三次及长期冷冻29天，稳定性较好。

2结果

2.1 血药浓度-时间曲线

12名志愿者空腹口服10mg、20mg和餐后口服20mg盐酸马尼地平片后，其马尼地平的平均血药浓度C（ng·mL-1）-时间t（h）如图1-图4；11名志愿者连续多次给药7天盐酸马尼地平片（10mg/片），其马尼地平的血药浓度C（ng·mL-1）-时间t（h）图5。

2.2药动学参数

单次空腹口服盐酸马尼地平片10mg、单次空腹口服盐酸马尼地平片20mg和餐后口服盐酸马尼地平片20mg后马尼地平的血药浓度经DAS2.1.1软件处理，得到的主要药动学参数结果见下表2。

受试者连续多次给药7天盐酸马尼地平片（10mg/片）的血药浓度经DAS2.1.1软件处理，得到的药动学参数结果见下表3：

2.3单次、多次给药药代动力学参数分析

2.3.1血药浓度-时间曲线

12名志愿者（男女各6人）空腹口服10mg、20mg和餐后口服20mg盐酸马尼地平片后，其马尼地平的平均血药浓度C（ng·mL-1）-时间t（h）如图6-图8；以及11名志愿者连续多次给药7天盐酸马尼地平片（10mg/片），其马尼地平的血药浓度C（ng·mL-1）-时间t（h）图9。

2.3.2男女受试者药动学参数比较

男女受试者单次给药10mg、20mg、餐后给药20mg和连续多次给药10mg后主要药动参数均值如下表4：

空腹口服盐酸马尼地平片10mg、20mg、餐后口服盐酸马尼地平片20mg和连续多次给药后男女药动学参数AUC、Cmax 、Tmax比较p>0.05无统计学意义。

2.3.3单次空腹和餐后口服盐酸马尼地平受试者药动学参数比较

空腹单次口服10mg与空腹单次口服20mg比较，Cmax、AUC0-t均增大约一倍，Tmax无明显差异；餐后口服20mg与空腹口服20mg比较，Tmax明显变大，Cmax和AUC0-t餐后比空腹均增大了约一倍。

2.3.4单次空腹口服和连续给药盐酸马尼地平受试者药动学参数比较

受试者单次口服10mg和多次连续口服盐酸马尼地平片后药代动力学参数比较见下表5：

结果显示，多次给药与单次比较Cmax、AUC、Tmax （p>0.05），均无统计学意义。

3结论

健康受试者按试验设计服用不同剂量的盐酸马尼地平片后，空腹单次口服10mg与空腹单次口服20mg药动学参数比较，Cmax、AUC0-t均增大约一倍，Tmax无明显差异。空腹、餐后和连续多次口服盐酸马尼地平片后男女药动学参数比较p>0.05，均无统计学意义。餐后口服20mg与空腹口服20mg后药动学参数比较显示，食物明显延长Tmax，Cmax和AUC0-t餐后比空腹均增大了约一倍。按10mg/每次，每日1次，连续用药7日给药方案，受试者多次口服盐酸马尼地平后，第4，5，6，7日的谷浓度接近，即多次服药后血浓度达到稳态。多次口服盐酸马尼地平与单次口服给药的Cmax、AUC的p>0.05无统计学意义，继而说明多次连续给药后，盐酸马尼地平在体内无蓄积。

4讨论

加入100%eL氢氧化钠（1mol·L-1）的目的：采用的离子模式是正离子的ESI源，要求样品具有碱性，并且盐酸马尼地平在酸性条件下萃取低，所以加入1mol·L-1氢氧化钠碱化盐酸马尼地平后，回收率明显提高，且有了较大的峰面积。

本研究在血浆处理过程中对提取溶剂作了考察，比较了乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷、乙醚对样品的提取效，发现用正己烷提取效果均不好，尝试用正己烷：二氯甲烷=3：1，正己烷：乙酸乙酯=3：1，发现正己烷：乙酸乙酯=3：1提取效果比以上都好，调节正己烷：乙酸乙酯=2：1和正己烷：乙酸乙酯=1：1发现提取效果最好的为2：1，因此采用正己烷：乙酸乙酯=2：1作为提取剂。

流动相和色谱柱的选择：用甲醇：0.1%甲酸=85：15，色谱柱用菲罗门2.0？00mm，C18柱，峰形很差，改变流动相为5mmoL/L乙酸铵溶液（含0.5%的冰乙酸）：甲醇：乙腈=15：40：45，峰形较好，但是在进处理后的血浆样品时，发现基质干扰严重，换用菲罗门4.6？50mm，C18柱，无明显基质干扰，但是峰形变差，换用ZORBAX RX-C8 4.6？50 mm，5%em（Agilent）色谱柱，峰形较好，无明显基质干扰，所以最后选择流动相为5mmoL/L乙酸铵溶液（含0.5%的冰乙酸）：甲醇：乙腈=15：40：45，色谱柱为ZORBAX RX-C84.6？50 mm，5%em（Agilent）。

本研究建立的LC-MS/MS方法，具有操作简便、快速、准确等特点， 用此法完成单次、多次给药药动学试验血浆样本的检测，通过二隔室模型法得到了相应的药动学参数，通过对药动参数进行分析，得到空腹单次口服10mg与空腹单次口服20mg药动学参数比较，Cmax、AUC0-t均增大约一倍，Tmax无明显差异；空腹、餐后和连续多次口服盐酸马尼地平片后男女药动学参数比较均无显著差异；食物明显延长Tmax，Cmax和AUC0-t餐后比空腹均增大了约一倍。因为高脂餐后，一方面能降低胃排空速率，增加药物在胃内的停留时间，另一方面高脂肪饮食可促进胆汁的分泌，提高药物的吸收。但目前食物对药物生物利用度及药代动力学方面的研究在国内并未引起足够的重视，尤其是现在仿制药的大量出现，我们更应该考虑空腹和餐后的生物利用度及药代动力学是否等效。此外多次连续给药在体内无蓄积，从而为临床合理用药提供依据。

参考文献

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