芸香草不同极性提取物的体外抗氧化活性研究

木妮热·依布拉音 尤努斯江·吐拉洪 杨艳梅等

摘要[目的]芸香草不同极性提取物中多酚含量的测定并研究其体外抗氧化活性。[方法]用70%乙醇、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水等溶剂对云香草进行提取，分别测量其中的多酚含量，并以其中的多酚为基准，比较分析各提取物的抗氧化活性。[结果]云香草70%乙醇、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水提取物多酚含量分别为3.87、0.52、0.41、0.83和1.57 mg/g，即提取液极性增大时，多酚含量也相应增加；各提取物均有一定的抗氧化活性，所含多酚质量浓度相同时，70%乙醇和水提取物的抗氧化活性较大，并与抗坏血酸相近，而氯仿、乙酸乙酯、正丁醇的抗氧化活性较小。[结论]芸香草多酚以极性多酚为主，且其抗氧化活性随多酚极性的增加而加强的趋势。

关键词芸香草；多酚；抗氧化活性；体外；极性提取物

中图分类号S567；R286；R965文献标识码A文章编号0517-6611（2014）23-07738-03

作者简介木妮热·依布拉音（1966- ），女，维吾尔族，新疆乌鲁木齐人，副主任技师，从事微生物检验研究。*通讯作者，副教授，从事天然产物活性成分研究。

收稿日期20140709芸香草[Cymbopogon distans（Nees et Steud）W.Watson]為禾本科多年生草本植物，又名韭叶芸香草、诸葛草、臭草，属多年生草本，有香气，常生于海拔稍高的石山组破草地，分布于我国新疆、甘肃、陕西、西南及印度、尼泊尔、巴基斯坦等地[1]。芸香草含有挥发油、酸性皂甙类物质、鞣质、蛋白质、粘液质、苦味质、糖类及酚性物质，其精油可直接用作皂用和化妆品用香精，还可以用于杀虫和消毒剂[2]。全草可做药材，其味辛、微苦、性温，民间常用于解表、利湿、止咳平喘，主治风寒感冒、伤暑、吐泻腹痛、小便淋痛、风湿痹痛、咳嗽气喘[3]。对芸香草的化学成分和药用作用研究还处在起步阶段，如杜清等利用硅肢柱层析分离纯化，鉴定了β谷甾醇、齐墩果酸和尿囊素等3种化合物[4]；薛敦渊等对芸香草精油化学成分中鉴定出了松油烯、胡椒酮、十氢-1等26种化学成分[5]。笔者对芸香草不同极性提取液体外抗氧化活性进行了初步研究，为芸香草的认识及进一步开发提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验仪器723型可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司制造）；RE52旋转式蒸发器 （上海亚荣生化仪器厂）；DXF200植物粉碎机（中山市东凤镇安密尔电器厂）；PHB8型笔试PH计（上海佑科仪器仪表有限公司）；SHBⅢ循环式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。

1.2试验材料芸香草购自于新疆维吾尔民族医院，阿不拉江博士鉴定为芸香草。用植物粉粹机粉粹成粉末后，阴凉干燥处密闭保存。没食子酸（≥98%），上海源叶生物科技有限公司；2，2二苯基1苦味酰基自由基（DPPH·）为美国Sigma公司；抗坏血酸、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、邻苯三酚、三氯乙酸等化学试剂均为国产分析纯试剂，Folinciocalten试剂按文献[6]配制。

1.3试验方法

1.3.1芸香草多酚的提取。称取2份芸香草样品各10 g，加70%乙醇200 ml，在50 ℃超声提取40 min，用三层的中速定性滤纸过滤后，低速离心得滤液，滤渣重复提取3次，合并滤液，浓缩至50 ml，得粗提取液备用。其中一份粗提取液依此用20 ml的氯仿、乙酸乙酯、正丁醇恒温萃取20 min，重复5次，合并各萃取相，减压浓缩并定容至50 ml，得氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相样品溶液。芸香草不同极性提取物的制备流程如所示。

芸香草不同极性提取物的制备流程1.3.2芸香草中多酚含量的测定。

1.3.2.1没食子酸对照品溶液标准曲线的绘制[7]。精确称取0.075 g没食子酸标准样品，蒸馏水溶解并定容于50 ml容量瓶中，从中移取5.0 ml用蒸馏水至50 ml，得浓度为0.15 mg/ml标准液。精密吸取此标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 ml于25 ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至10 ml，各加入Folinciocalten试剂1.0 ml，摇均后再加入20%的Na2CO3溶液2.0 ml，置于50 ℃的水浴10 min，冷却并定容到25 ml，室温放置30 min。同时以不加对照品的为空白，在760 nm波长处测定标准品溶液的吸光度，得到没食子酸含量Y（μg/ml）与吸光度A之间的回归方程。

1.3.2.2芸香草不同极性提取液中多酚含量的测定。分别移取芸香草不同极性溶剂提取液样品1.0 ml，用蒸馏水稀释至10 ml ，再取1.0 ml，其余按“1.3.2.1”方法操作，测定体系在波长760 nm处的吸光度，并从没食子酸标准曲线方程式中求出芸香草不同极性提取液中的多酚含量。

1.3.3芸香草中多酚的抗氧化活性的测定。

1.3.3.1还原力的测定[8]。移取浓度为0.5 mg/ml的芸香草不同极性提取液0.4 ml，稀释至1.0 ml，加2.5 ml磷酸盐缓冲液PBS（0.2 mol/L，pH 6.6）摇均，再加入1%铁氰化钾2.5 ml摇均，置于50 ℃水浴恒温反应20 min，加10%三氯乙酸溶液1 ml，摇均，3 000 r/min离心5 min；取上清液2.5 ml，加水2.5 ml稀释，再加入0.1% 三氯化铁0.5 ml，避光反应10 min后在波长760 nm处测定吸光度。每个样重复测定3次，取平均值。同时在相同条件下测定抗坏血酸（VC）的还原力。

1.3.3.2DPPH·自由基清除能力的测定[9]。移取适当浓度的芸香草不同极性提取液各2.0 ml于具塞试管中，加入0.010 mg/ml的DPPH·乙醇溶液2.0 ml，混合均匀，静置30 min 后倒入1 cm的比色皿中，在517 nm处测定其吸光度值，同时测定样品空白以及不加样空白的吸光度值。每个样重复测定3次，取平均值。同时相同条件下测定抗坏血酸（VC）对DPPH·自由基清除能力。按下式计算其对DPPH·的清除率，即DPPH·的清除率（%）=1-A-A1A0×100，式中，A0为DPPH与无水乙醇吸光度； A1为样品与无水乙醇吸光度；A为样品与DPPH·吸光度。

1.3.3.3羟基自由基清除率的测定[10]。向25 ml容量瓶中依次加入7.5 mmol/ml邻二氮菲溶液1.0 ml、PBS（pH=7.4）5.0 ml、7.5 mmol/ ml FeSO4溶液1.0 ml，一定量的抗氧化剂溶液（损伤管及未损伤不加提取液）、体积分数为0.1%双氧水1.0 ml（未损伤管不加），以蒸馏水定容，暗处放置60 min，在510 nm处测定吸光度。以上每加一次试剂需摇均。每个样重复测定3次，取平均值。同时以抗坏血酸（VC）作为对照物。羟自由基清除率计算公式为：羟自由基的清除率（%）=A样品-A损伤A未损-A损伤×100。

1.3.3.4超氧阴离子自由基的清除率的测定[11]。取50 mmol/L 的4.5 ml TrisHCI 缓冲溶液（pH=8.2），4.2 ml 蒸馏水混匀后在25 ℃预热过的3 mmol/L 邻苯三酚0.3 ml，迅速摇匀后倒入比测皿，420 nm 下每隔30 s 测定吸光度，总4 min。以10 mmol/L HCI溶液配制空白管作为对照。按照上述步骤在加入邻苯三酚前先分别加入1.0 ml 芸香草不同溶剂提取液，蒸馏水减少。同样以10 mmol/L HCI溶液配制空白管作为对照。同时在相同条件下测定抗坏血酸（VC）对超氧阴离子的清除能力，测定吸光度。超氧阴离子自由基的清除率的测定计算公式为：超氧阴离子自由基的清除率（%）=ΔA1-ΔA2ΔA1×100。

2结果与分析

2.1没食子酸对照品的标准曲线的绘制按“1.3.2.1”项的试验方法，在760 nm波长处测定标准品系列溶液的吸光度，以没食子酸含量（μg/ml）为横坐标、相应吸光度为纵坐标进行线性回归，得到食子酸的标准曲线（），其回归方程为y=0.009 0x+0.018 3（R2=0.996 3 ）。从可看出，在0～84 μg/ml有良好的线性关系。

没食子酸的标准曲线2.2芸香草不同极性溶剂提取液中多酚含量总多酚含量以FolinCiocalteu法测定，结果根据标准曲线计算，所得结果表明，70%乙醇作为溶剂的粗提取液的多酚含量最多，乙酸乙酯相的多酚含量最小，其顺序为70%乙醇（3.87 mg/g）>蒸馏水（1.57 mg/g）>正丁醇（0.83 mg/g）>氯仿（0.52 mg/g）>乙酸乙酯（0.41 mg/g），溶剂极性越强，总酚含量越高。根据相似相溶原理可知芸香草多酚以极性酚为主，极性酚含量显著高于弱极性酚含量。

2.3芸香草多酚抗氧化活性的研究

2.3.1芸香草不同极性提取物的还原力。还原力的测定以样品是否为电子供体为指标，供应的电子除了可使 Fe3+还原为Fe2+ 外，亦可与自由基反应，使自由基成为较稳定的物质。根据测得的吸光度值可以测定样品还原能力的大小[12]。吸光度值越大，表明抗氧化剂对Fe3+还原能力越强。从可以看出，芸香草不同极性提取物均有一定的还原力，在相同浓度下还原力最大的是抗坏血酸（VC），其次是70%的乙醇提取液，还原力最小的是乙酸乙酯提取液，其还原力相当于VC的1/3。

芸香草不同极性提取物的还原力2.3.2芸香草不同极性提取物对DPPH·自由基清除能力。DPPH·为一相当稳定的自由基，其甲醇溶液在517 nm附近有强的吸光值，当被抗氧化剂还原，或与另外一个自由基结合时，吸光值均会降低，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系[13]。在DPPH·溶液中加入自由基清除剂时，溶液颜色变浅，最大吸收峰处的吸光度变小，而吸光度变小的程度与自由基被清除的程度呈线性关系。因此，可用自由基的清除情况来评价某物的抗氧化能力。其抗氧化能力用清除率表示，清除率越大，抗氧化能力越强。采用“1.3.3.2”节的方法测定不同极性芸香草多酚对 DPPH· 自由基的清除作用，芸香草不同极性提取物的DPPH·的清除能力结果表明（），芸香草不同极性提取液对DPPH·均有一定的清除能力，且均具有明显的量效关系。提取物中多酚浓度均为0.100 mg/ml时，70%乙醇、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水提取液和VC等对DPPH·的清除率分别为95.55%、55.91%、80.80%、81.78%、94.15%和99.72%，70%乙醇和水提取液对DPPH·有较强的清除作用，其清除率与VC的相近。

2.3.3芸香草不同极性提取物对羟基自由基的清除能力。羟自由基（·OH）是一种氧化能力很强的自由基，它能够很容易地氧化各种有机物和无机物，氧化效率高，反应速率快，是造成组织脂质过氧化、核酸断裂、蛋白质和多糖分解的活性氧，与机体的衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞噬有关。通过Fenton反应所产生的·OH，可使邻二氮菲—Fe2+水溶液氧化为邻二氮菲—Fe3+，从而使邻二氮菲—Fe3+在510 nm处的最大吸收峰消失，据此可推知系统中·OH的量的变化[14]。采用Fenton法测定了芸香草不同极性提取液对·OH的清除作用，结果表明（），各提取液对·OH均有一定的清除作用，它们的多酚浓度相同（0.100 μg/ml）时，各提取液对羟自由基的清除率的大小为VC>水>70%乙醇>正丁醇>氯仿>乙酸乙酯。

芸香草不同极性提取物對·OH的清除力2.3.4芸香草不同极性提取物对超氧阴离子自由基的清除能力。邻苯三酚在碱性条件下发生自氧化释放氧阴离子自由基（·O-2），并生成有色中间产物，该有色中间产物在420 nm 波长处有一特征吸收峰，当有抑制剂存在时，可清除·O-2，从而阻止中间产物的积累，可通过比色法来检测有色中间产物的含量，以检测物质清除·O-2的能力[15]。该试验利用这一特点，测定不同时间反应体系的吸光度，测得邻苯三酚自氧化速率和加入不同极性提取液后邻苯三酚自氧化速率，间接测定各提取液对·O-2的抑制率。从可以看出，芸香草不同极性提取液对超氧阴离子有一定的清除能力，各提取液多酚浓度相同（0.100 μg/ml）时，对·O-2清除能力从大到小的顺序为70%乙醇>VC>水>正丁醇>氯仿>乙酸乙酯，其中70%乙醇对·O-2清除能力与VC相当，而乙酸乙酯提取物对·O-2清除能力是VC的1/4。

芸香草不同极性提取物对·O-2的清除力安徽農业科学2014年3讨论

多酚是植物原料的一种重要次生代谢产物，是绝大多数植物性食品和药材的活性成分。使用不同极性溶剂可以提取不同极性（即种类）的酚类化合物，它们在结构和性质上有所不同。该试验用70%乙醇、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水等溶剂超声提取了芸香草中多酚，被提取的多酚含量顺序为70%乙醇>水>正丁醇>氯仿>乙酸乙酯。溶剂极性越强，总酚含量越高，根据相似相溶原理可知芸香草多酚以极性酚为主，极性酚显著高于弱极性酚含量。芸香草提取物对DPPH·自由基 、羟自由基、超氧阴离子自由基的清除率和还原力的大小也与溶剂极性密切相关，总的来说，极性越强的多酚，其抗氧化活性也越强。为了更准确地表征芸香草抗氧化作用机理，有必要对提取物中多酚单体组分进行分离、纯化和结构鉴定。

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