结肠癌干细胞的筛选及其耐药性研究

韩文遒

【摘要】结肠癌干细胞是一小部分存在于结肠癌中具有自我更新、无限增殖和多项分化潜能的肿瘤干细胞。许多研究已证实在包括结肠癌在内的多种实体瘤中存在肿瘤干细胞，它与结肠癌的复发、转移和治疗耐受有着密切的联系。虽然癌干细胞在肿瘤细胞总数中只占很小比例，但是在肿瘤的起源、发展、转移以及复发等方面均有重要的作用。本研究对结肠肿瘤干细胞的筛选及耐药性进行了探讨。

【关键词】肿瘤干细胞；筛选；耐药性

【中图分类号】R739.4 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2014）03-0141-02

1结肠癌干细胞的筛选

1.1筛选方法

肿瘤干细胞是肿瘤研究中的一大难题，其中最困难的是如何从肿瘤组织中分离出肿瘤干细胞。目前，分离和纯化肿瘤干细胞的方法主要有三种，但各有各的优缺点。一是无血清培养形成细胞球，亦是富集肿瘤干细胞的方荧；二是荧光染料法，但此种方法有一定的局限性；三是表面标志分子筛选法，又可分为流式细胞仪分选法和免疫磁珠分选法。这两种方法均利用肿瘤干细胞表面特异的标志分子与带有标志的抗体结合，从而使其与非肿瘤干细胞分离。

1.2筛选过程

采用干细胞球培养法筛选结肠癌干细胞时，要取生长状态良好的结肠癌细胞制成单细胞悬液并计数，取单个细胞放入肿瘤干细胞培养基中悬浮培养，每天晃动几次，防止细胞贴壁，待细胞球变大，亮度降低，结构变松散时用酶消化传代，取亲本及传代后细胞放入孔板中培养后，计算成球率。取生长状态良好的结肠癌干细胞球置于含有牛血清的中培养，观察细胞贴壁分化情况进行磁珠分选。磁珠分选后，采用流式细胞术检测分选后细胞中含有表面抗原分子细胞含量。为了检测结肠癌细胞形成的癌细胞克隆球的抗原分子蛋白表达情况，接种后第6天克隆细胞球被采用免疫荧光检测。将分选后的细胞分别接种于无血清培养基中，检测标记细胞的体外增殖能力。

1.3标志分子的功能及其在结肠癌干细胞筛选中的应用

筛选结肠癌干细胞的标志分子大部分根据其表达水平而定，但标志分子在肿瘤干细胞中的功能尚不清楚。尽管结肠癌一直被认为起源于肿瘤干细胞，但因缺乏可靠的生物学标记，直到最近这个假说才得以证实。表面抗原分子是第一个用于筛选结肠癌干细胞的表面标志分子，是维持肿瘤干细胞干性的重要分子。以表面抗原分子筛选所得到的结肠癌细胞经鉴定具有体内成瘤能力，然而有研究发现表面抗原分子和转移后的结肠癌细胞都具有体内成瘤能力，这使利用表面抗原分子筛选结肠癌干细胞令人质疑。因此，利用表面抗原分子来筛选肿瘤干细胞需进一步的验证。跨膜糖蛋白是另一个在肿瘤中运用广泛的筛选肿瘤干细胞的标志分子，也是第一个应用于判断肿瘤放射治疗疗效的干细胞标志分子根据跨膜糖蛋白的表达来判断肿瘤组织中肿瘤干细胞的密度，从而就能达到预测放射治疗的效果。研究发现肿瘤干细胞标志分子在诱导与维持细胞与基质之间的链接起着重要作用，同时也能增强肿瘤细胞在新环境的增殖能力。

2结肠癌干细胞的耐药性研究

2.1引起肿瘤干细胞产生耐药性的原因

恶性肿瘤的治疗方法主要有手术、化疗和放疗。其中化疗是最主要的治疗手段。但由于肿瘤干细胞可以产生耐药性，使得肿瘤可以对多种化疗药物产生耐受，最终导致化疗失败。导致肿瘤干细胞产生耐药性的主要原因有以下几点。一是高表达转运蛋白可以参与多种跨膜转运过程，将糖类、脂类、氨基酸及细胞毒性药物等大分子物质逆浓度梯度转运到细胞外；二是肿瘤干细胞通常很少处于细胞生长的增殖期，当其收到一定刺激时会重新进入有丝分裂期，造成肿瘤复发；三是临床上常用的化疗药物的作用机制之一是诱导细胞凋亡，而肿瘤干细胞内细胞凋亡受到抑制，对这类化疗药物不敏感；另外，化疗药物的作用靶点通常是DNA，而肿瘤干细胞内的多种酶可以促进DNA的损坏修复功能，使肿瘤干细胞无法收到这类药物的作用。

2.2腫瘤干细胞的耐药性实验及结论

可靠的肿瘤干细胞筛选将为肿瘤干细胞干性及分化信号通路调节机制研究奠定基础。经实验证实，结癌干细胞对传统化学治疗药物比一般的肿瘤细胞具有更强的耐受性。处于静止期或慢周期状态是成体干细胞的一个重要特点，研究表明肿瘤干细胞也大多处于静止状态，并参与了肿瘤的耐药、复发和转移。细胞周期检测发现干细胞中处于静止期的细胞要明显多于亲本细胞，一方面表明肿瘤干细胞与成体干细胞的相似性，另一方面也进一步解释了肿瘤干细胞对细胞周期特异性药物的耐药性。实验结果还显示了结肠癌干细胞富集与耐药的相关性。干细胞球细胞对不同药物的耐药性均明显高于亲本细胞，其中细胞处于静止期使细胞对药物周期特异性的耐药，而表达升高使细胞对不同种药物均耐受，表现出多药耐药性。结肠癌治疗多年后复发及远处转移都与残留的结肠癌干细胞有关。因此，肿瘤干细胞靶向治疗具有重要的研究前景。

2.3肿瘤干细胞的靶向治疗

目前肿瘤干细胞靶向治疗的原理就是利用其表面表达的标志分子开展的。通过组织芯片发现这种标志分子抗原在不同临床病理分期的结肠癌中均有表达。这表明碳末端抗原表位可作为潜在的分子靶点，而化疗药物就可特异性结合到这个靶点，继而靶向治疗结肠癌。在临床结肠癌的治疗方面，一些研究者发现细胞膜表面表达的膜蛋白可以作为直接靶向目标或间接介导凋亡诱导复合物的内部分化而杀死肿瘤细胞。目前结肠干细胞的表面标志仍然不明确，因此，是否存在其他亚群的结肠癌干细胞仍是科学研究的方向。随着研究的进一步深入，可能会出现更多结肠癌干细胞表面标记，使得更为精细和科学的结肠癌干细胞的分离、鉴定成为可能。

3结语

干细胞标志分子在结肠癌干细胞研究中的作用是不容置疑的，但是目前对肿瘤干细胞生物学特性的功能仍不清楚。由于结肠癌干细胞迄今缺乏高特异性生物标记，生物学特性复杂，要开展靶向治疗还有待探索。对结肠癌干细胞的深入研究，有可能会从全新的角度去阐明结肠癌发生、发展的机制，从而为结肠癌的诊断、治疗提供一种新的思路，具有无限的发展空间和深远的科学意义。

参考文献

[1]汪春良，夏良，孙玉岭，结肠癌患者术前外周静脉血CD133阳性细胞数量与血清癌胚抗原及肿瘤进展的关系，实用医学杂志，2008；

[2]张洪也，程勇，胡祥，等，LoVo细胞系中结肠癌干细胞样细胞的分离、培养及鉴定，中国肿瘤生物治疗杂志，2010

[3]青青，王媛媛，张绍衡，等，结肠癌细胞体外模拟缺氧的相关研究，南方医科大学学报，2011，