Survivin基因沉默抑制肺腺癌A549细胞增殖并增强其对吉非替尼的敏感性

张风林 张振安 张静

【摘 要】目的：研究Survivin基因沉默对人肺腺癌A549细胞增殖和对化疗药物吉非替尼敏感性的影响。方法：设计合成survivin的siRNA序列，LipofectamineTM2000 转染入A549细胞。采用RT-PCR和Western blot检测survivin在干扰后mRNA和蛋白的表达情况，利用流式细胞仪检测细胞周期。通过MTT法和细胞克隆形成试验法察survivin基因沉默后A549细胞对吉非替尼的敏感性。结果：Survivin基因沉默48h后，A549细胞的survivin基因和蛋白表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。细胞周期被阻滞在G0/G1期，S期细胞数减少；差异有统计学意义(P<0.05)。survivin基因沉默组细胞对吉非替尼的敏感性显著性增强。结论：特异性siRNA介导的Survivin使细胞A549增殖减少，增强其对易瑞沙的敏感性。

【关键词】Survivin；siRNA；肺腺癌；A549细胞；细胞增殖；吉非替尼

【中图分类号】R394 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）03-01113-02

肺癌位居我国恶性肿瘤死亡原因的首位，占全部恶性肿瘤死亡原因的22.7%。我国目前肺癌发病率每年增长26.9%，预计到2025年，我国的肺癌患者将达100万，成为世界第一肺癌大国[1]。肺癌对人们健康造成很大危害，本文通过将合成的siRNA转染入肺腺癌A549细胞，分析siRNA对其Survivin基因沉默的效率；Survivin基因被沉默后对肿瘤细胞周期及其对吉非替的敏感性的影响。为RNA干扰Survivin基因治疗肺癌或做为增敏药物提供实验依据。

1 材料和方法

1.1主要材料

肺腺癌细胞株A549购于中国科学院上海细胞究所。MI 1640培养液、胰蛋白酶和胎牛血清均购自美国Gibco公司。LipofectamineTM2000脂质体转染试剂和TRIzol购自美国Invitrogen公司；RT-PCR两步法试剂盒(北京赛百盛基因技术有限公司)， cDNA合成试剂盒(日本TOYOBO公司)；AMV逆转录试剂盒(杭州博日)； siRNA基因片段由上海生工生物工程公司合成；G418购自美国Klontech公司；Survivin鼠抗人单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；5%四甲基偶氮唑蓝、HRP标记的羊抗鼠二抗购自北京中杉公司；吉非替尼（AstraZeneca UK Limited）；流式细胞仪（COULTER XL; Coulter）；550酶标仪（美国Biorad公司），生物倒置显微镜（Olympus CKX4）。ECL试剂盒购自美国Thermo公司；RIPA蛋白裂解液购自江苏碧云天公司。

1.2siRNA设计、合成及转染

根据Genebank中 Survivin cDNA (Acc.No.U75285)的序列 ,通过相应计算机软件设计靶向 survivin mRNA 45- 65序列，由21个碱基组成的核苷酸链,其序列为: 5-GG ACCACCGCAUCUCUACADTDT- 3 ,同时合成互补链 ,经退火形成双链 ( dsRNA) ,即特异性 的siRNA分子，经BLAST查询 ,确定为 survivin特性序列 ,排除与其他基因的同源性。阴性对照 siRNA的序列为:5- CGUACGCGGAAUACUUCG ADTDT-3 ,此序列不與人类任何基因序列同源。以上核苷酸分子均由上海生工生物工程公司合成。肺腺癌细胞株A549 培养在含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液中，置饱和湿度5％CO2，37℃恒温培养箱中培养。每2天传代1次，实验时取对数生长期的细胞。按1 × 10 5个／孔将肺A549细胞接种于24孔板中，至融合率达70％时以脂质体法进行转染。按基因转染试剂盒说明书进行转染，转染时分为3组：转染pGenesil-1-survivin-siRNA载体者为A549／survivin-siRNA组(实验组)，转染随机对照载体者为A549／control组（对照组），未转染的肺腺癌细胞株A549细胞为A549组（空白组）。于转染后48h行 RNA 干扰效应的检测。

1.3 RT-PCR检测

细胞弃培养液后PBS冲洗3次，通过TRIzol法提取总RNA，用cDNA合成试剂盒反转录合成cDNA。分别扩增Survivin和内参GAPDH。Survivin引物序列:正义：5＇-CACCGCATCTCTACATTCAA-3＇，反义：5＇-CTCTTTCTTCGCAGTTTCCA-3＇，扩增产物为345bp。GAPDH 正义：5＇-GTGTCAACGGATTTGGTCGA-3＇， 反义：5＇-GACAAGSTTCCCGTTCT CAG-3＇，扩增产物为180 bp。PCR反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环。PCR产物采用2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，使用凝胶图像分析系统进行吸光度扫描并用Survivin吸光度/GAPDH吸光度值作为mRNA表达的相对强度。

1.4 Westem blot检测

细胞弃培养液后PBS冲洗3次，加入预冷的RIPA裂解液150 μL，RIPA裂解液预先加PMSF1.5 μL使其终浓度为1 mmol/L。操作在冰上进行， 4 ℃下，10 000 r／min离心5 min后取上清液，通过BCA法测蛋白浓度后，99 ℃ 变性10 min。取50 μg蛋白行10%SDSPAGE电泳，通过电转移印迹到PVDF膜上，封闭液中孵育1 h. 加入1∶1000稀释的survivin一抗，4℃过夜. TBST洗膜5 min, 共3次. 加入1∶5000 HRP标记的二抗和GAPDH, 于37℃孵育2 h. PBS洗涤，采用ECL法检测。

1.5 流式细胞仪检测细胞周期

收集三组细胞，调整细胞浓度为1×106/L，冷PBS 洗涤2 次, 加入70 %的冷乙醇(4 ℃) 固定24 h后，洗涤细胞，与含10 μg/ ml RNA 酶的Tris-HCL缓冲液(pH7. 4) 共同孵育30 min。50μg/ ml 碘化丙啶( PI)进行细胞的DNA 染色，1 h 内通过流式细胞仪分析细胞的DNA含量分布，并计算出各个周期细胞所占的百分率。

1.6 MTT检测干扰Survivin后A549对吉非替尼的敏感性

细胞转染干扰质粒48 h后，收集转染和未转染的A549细胞， 接种于96孔板 ， 每个样本做3个复孔， 当细胞贴壁后，加 入不 同浓度的吉非替尼 (2.5、5、10 、20 μmol/ L )培养48 h ；每孔加MT T 20μl (浓度为5mg/ml)，放置孵箱内4h后弃上清加入10%的SDS（十二烷基磺酸钠）200μl，过夜。震荡15min，用全自动酶标仪（检测490nm处的吸光度值（A值）。抑制率（%）=（A对照-A实验）/（A对照-A空白）×100%。

1.7平板克隆检测干扰Survivin后A549对吉非替尼的敏感性

细胞转染干扰质粒48 h后，收集转染和未转染的A549细胞， 接种于6孔板 ， 每个样本做3个复孔， 细胞贴壁后，加入不 同浓度的吉非替尼 (2.5、5、10 、20 μmol/ L )培养中培养7天，去除培养液，PBS洗2次，95%乙醇固定10 min，吉姆萨染液染色10 min，自来水冲洗后，晾干，通过Quantity One软件计算克隆数。克隆形成抑制率（%）=1-（实验组克隆数/对照组克隆数）×100%。

1.8 统计学处理

本研究采用SPSS14.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（ ±s）表示，两组间连续变量比较用t检验，多组间连续变量比较用方差分析，协方差校正，双侧检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 siRNA抑制Survivin mRNA的表达

Survivin mRNA表达的RT-PCR检测与A549／control组（对照组）和A549组（空白组）比较，A549／Survivin-siRNA组（实验组）条带明显变窄，实验组与对照组和空白组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1

Fig.1 Detection of Survivin mRNA expression in A549 cells by RT-PCR

2.2siRNA抑制Survivin蛋白的表达

Survivin蛋白表达的Western blot检测与A549／control组（对照组）和A549组（空白组）比较，A549／Survivin-siRNA组（实验组）条带明显变窄， 其灰度值比较差异有 统计学意义 (P<0.05)。见图2。

2.3流式细胞仪检测细胞周期

流式细胞仪分析各组A549细胞的细胞周期，结果显示，在G0/G1期实验组较对照组和空白组略有增加，S期略有减少。实验组与对照组、空白组之间差异有统计学意义(P<0.05)，M期细胞无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)。说明有明显的S期阻滞(表1)。

2.4 干扰Survivin后A549對吉非替尼的敏感性提高

MTT法检测结果显示， 在转染pgsiRNA—Survivin后，A549细胞对不同浓度的吉非替尼敏感性均提高 。随着药物浓度的增加，吉非替尼对细胞的抑制率也增加，呈现出剂量依赖性，实验组细胞对不同浓度的吉非替尼敏感性显著高对照组和空白组 (均P<0.05 ) ( 表 2 )。

2.5对A549细胞集落形成的影响

平板克隆检测显示， 转染 pgsiRNA—Survivin后，A549细胞对不同浓度的吉非替尼敏感性均提高，细胞克隆形成数明显减少，克隆形成抑制率明显增高(P<0.05 )。随着药物浓度的增加，吉非替尼对细胞的克隆形成抑制率也增加，呈现出剂量依赖性，实验组细胞对不同浓度的吉非替尼克隆形成抑制率显著高于对照组和空白组 (均P<0.05 ) ( 表 3 )。

肿瘤的发生发展是由多种因素共同作用造成的，其中细胞凋亡在肿瘤的发生、发展及转移过程中起着重要的作用。凋亡抑制蛋白家族(Inhibitor of apoptosis proteins ，IAPs)在抑制细胞凋亡的过程中起到重要作用[2-3]。Survivin是近年发现的IAPs家族的成员之一，它具有独特结构的，几乎表达在所有肿瘤细胞中,而在除胸腺外的正常成人组织中不表达,它与肿瘤的凋亡、增殖及耐药性的产生有着密切的关系,是肿瘤基因治疗的新靶点[4-6]。Survivin在恶性肿瘤中具有较高的表达水平，和肿瘤的淋巴节转移、临床病理分期等都有密切的关系。研究[7]显示survivin是caspase3和caspase7的直接抑制因子，主要通过抑制Caspase3、Caspase7的活性，来阻断细胞的凋亡过程，使Caspase3不能降解微管结构蛋白，维持了纺缍体的完整性，可以确保胚胎细胞有丝分裂的顺利进行，而在肿瘤组织中survivin过度表达，使肿瘤细胞不断分裂，恶性增殖永生化，使肿瘤持续生长。因此针对Survivin干预肿瘤生长有着很大的潜力，有研究[8-9]报道干扰survivin基因后，对结肠癌有着较好的效果。对鼻咽癌也有类似报道[10]。

吉非替尼是E G F R酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，EGFR—TKI)。当EGFR与其配体 ( EGF，TGF-a ) 结合后被激活。介导着一系列的细胞生长信号，继而促进肿瘤形成和侵袭性生长，EGFR表达增高提示肿瘤预后不良.吉非替尼是临床应用较早 EGFR—TKI，可特异性作用于肿瘤细胞，而对机体正常组织无毒或低毒，因而是理想的药物。广泛的应用于上皮性肿瘤的治疗及增敏中。有关吉非替尼治疗肺癌的临床研究[11-12]提示，其在特定的人群如女性、不吸烟、腺癌患者中，吉非替尼能提高无进展生存期，提高生活质量和生存率。但是对于肿瘤的治疗需要多途径多通路的同时综合治疗才会显现较好的效果，对survivin基因抑制的靶向治疗与其它途径结合的治疗是研究的热点。有资料[13-14]显示，通过siRNA干扰诱导切除修复交叉互补基因(ERCC1)使survivin表达下调可以增加肺癌等肿瘤细胞对铂类药物的敏感性。Nakamura[15]等将野生型Survivin及其显性失活突变体分别转染入胃癌细胞发现，Survivin过表达可以使胃腺癌MKN45细胞逃避顺铂诱导的凋亡，而Survivin显性失活突变体的表达则增强顺铂对胃癌细胞株NUGC3细胞的凋亡诱导作用。各种方式对的survivin基因的干扰均对化疗药物治疗起到了较好的辅助作用[16]。

我們通过小分子Survivin干扰RNA利用流式细胞仪检测细胞周期,并MTT法观察吉非替尼对沉默Survivin后A549细胞的细胞的敏感性，结果发现Survivin基因被沉默后，细胞周期被阻滞在G0/G1期，S期细胞数减少，肿瘤生长停滞；吉非替尼对沉默Survivin后A549细胞的细胞的敏感性明显增加。说明沉默Survivin即可以直接有效降低细胞分裂增殖，也可以增加肺癌细胞对化疗药物的敏感性。本实验结果提示小分子Survivin干扰RNA沉默Survivin基因能够增加肺癌细胞对化疗药物的敏感性，可以成为治疗或辅助治疗肺癌的一个新方向。

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