实时荧光PCR用于流感病毒检测的效果分析

陈烨

【摘 要】 目的 探讨和研究实时荧光逆转录聚合酶链式反应在流感病毒检测中的应用效果。方法 采用实时荧光PCR对617例流感样病例患者的咽拭子标本进行流感病毒核酸的测定，对检测出的阳性标本采用MDCK进行培养并分离，对两种方法的检测结果进行分析，对比特异性及灵敏度。结果 本组617例标本中实时荧光PCR共检测出阳性标本152例，阳性率24.6%；细胞培养法在此152例阳性标本中共分离出流感病毒79例，阳性率12.8%，实时荧光PCR检测阳性率显著高于细胞培养法，差异具有统计学意义（P<0.05）。结论 实时荧光PCR能够快速有效的检测出流感病毒核酸，是实验室快速诊断的有效手段。

【关键词】 实时荧光PCR；细胞培养法；；流感病毒

【中图分类号】 R446.11+3 【文献标识码】 B

流行性感冒是临床上最为常见的急性呼吸道传染病，主要是由A、B、C三种流感病毒所引起，其中A、B型病毒存在变异大、危害强的特点，对患者的健康造成了很大的威胁[1]。笔者近年来采用实时荧光PCR对A、B型流感病毒进行了检测，并与细胞培养法进行了对比，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本、试剂及器材 标本选取为湖南桃源县监测哨点医院在流感爆发时就诊的流感样病例（体温38℃以上，伴有咳嗽、咽痛等症状），共617例患者，取咽拭子标本置于采样液中，于24h内送至实验室。选取7500实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（PCR）检测系统，RNA提取试剂盒由QIAGEN公司提供，反应试剂盒由北京北瑞达医药科技有限公司提供，狗肾传代细胞（MDCK）由湖南省疾病预防控制中心提供，抗A、抗B系病毒血清均由国家流感中心提供。

1.2 实时荧光PCR检测 对所采集的617例标本进行病毒核酸检测，RNA提取及反应体系均按照试剂盒说明进行，采用SDS软件进行实时荧光PCR系统的操作并设置阳性、阴性对照，反应程序包括：50℃（30min）、95℃（3min）、95℃（15s）、50℃（30min）、72℃（1min），设定5个循环；95℃（10s）、55℃（40s），设定40个循环。荧光素设定为FAM，55℃时进行荧光信号的收集。

1.3 细胞培养法检测 对实时荧光PCR检测到的阳性标本采用细胞培养法进行分离、接种及分型。每份标本按25ml/瓶接种，2瓶/份，次日观察是否出现细胞病变（CPE）。利用人O型红细胞进行血凝试验，观察血凝素（HA）及其滴度，将HA滴度<1：8或存在阴性培养物盲传2代后仍存在阴性者弃去。HA滴度符合试验标准者采用国家流感中心提供的标准参照血清进行HAI试验，对病毒进行分型。

1.4 敏感性及特异性检测 对细胞培养法检测出的阳性菌株取细胞培养液，按照实时荧光PCR检测步骤再次进行检验和分型。

1.5 统计学处理 采用SPSS 16.0进行统计学处理，计量资料用x±s表示，计数资料对比用X2检验，P<0.05视为对比具有统计学意义。

2 结果

2.1 实时荧光PCR检测结果显示，617份疑似病例中共检测出152例阳性病例，阳性率24.6%，对A、B型流感病毒的分型检测分别得到133例和19例，分别占87.5%和12.5%。

2.2 细胞培养法检测结果显示，在实时荧光PCR检测得到的152例阳性菌株中，获得79份流感病毒，总体阳性率12.8%，A、B流感病毒分型结果分别为66例和13例，分别占83.5%和16.5%。

2.3 检测结果对比显示，实时荧光PCR检测阳性率要显著高于细胞培养法，差异具有统计学意义（P<0.05）；在分型检测对比上，两组并无显著性差异（P>0.05）。

3 讨论

目前流感病毒的实验室诊断经典方法即为病毒的分离与鉴定，采用细胞培养法分离的流感病毒能够保证其抗原性与原始标本的一致，便于长期保存，在对该病毒抗原性和基因分析上有着较好的应用，但MDCK细胞分离的病毒不能用于疫苗的生产，从目前临床研究结果来看[2]，细胞培养法的检出率和病毒载量、被检样品质量等存在一定相关，一旦被检样品质量较少或病毒载量不足时就容易导致假阴性的产生。另外，细胞培养法仅针对活体病毒有效，在标本的采集、保存过程中要注意保持病毒活性。

实时荧光PCR能够快速、准确的对流感病毒进行检测，在2009年发生的甲型H1N1疫情中有着重要的作用。虽然细胞培养法是目前流感试验中最可靠的方案之一[3]，但此种方法对标本质量要求过高，操作复杂且试验周期较长，在流感疫情爆发，需要快速进行诊断时存在较大弊端[4，5]。从本文数据来看，实时荧光PCR检测阳性率显著高于细胞培养法，且对细胞培养法获得的79株流感病毒进行PCR分型结果与HAI实验结果相吻合，这说明实时荧光PCR的特异性值得肯定，同时具有方便快捷、高通量的特点，能够适用于流感病毒爆发期的快速、大面积检查，能够在3h内提供详细检测结果，为临床提供必要依据。

综上所述，实时荧光PCR能够快速有效的检测出流感病毒核酸，具有简单快捷、高通量、高特异性的特点，是流感疫情爆发时实验室快速诊断的有效手段。

參考文献

[1] 中华人民共和国卫生部.甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案[S]，2009.

[2] 徐苗，罗永艾，黎友伦，等.重组结核分枝杆菌11000蛋白对结核结核分枝杆菌感染的鉴别作用[J].中华结核和呼吸杂志，2006，29（11）：762-765.

[3] 中华人民共和国卫生部.全国流感/人禽流感监测实施方案 （2005-2010年度）[s].2005.

[4] 中华人民共和国卫生部.流行性感冒病毒诊断标准及处理原则 [S].GB15994-1995.

[5] 程小雯，吴春利，吕星，等.荧光定量RT-PCR技术快速检测A、B型流感病毒的研究[J].中国热带医学杂志，2005，9（5）：1782-1785.