Fas/FasL在辐射诱导胆管癌细胞凋亡发生和调控中的作用

赵晓丹 刘峥嵘 王红岩

【摘 要】胆管癌发病率逐年升高，但研究进展缓慢，发病机理远未明了，早期诊断困难，外科治疗棘手，放化疗均不敏感，预后差，是肿瘤临床的一大难题。但随着细胞凋亡的研究的进一步深入，给胆管癌的诊治带来了希望。Fas/FasL系统是凋亡发生和调控的重要因子。放疗对肿瘤的作用主要是诱导其细胞凋亡。而在辐射诱导胆管癌细胞的凋亡中弄清Fas/FasL对其调控机制对胆管癌的发生发展，诊断治疗及预后都有重要意义，本文结合有关文献作一综述。

【关键词】胆管癌；辐射诱导；细胞凋亡 Fas/FasL

【文章编号】1004-7484（2014）04-2115-02

1 对细胞凋亡途径的研究

细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用。它在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。目前对细胞凋亡途径的研究已比较深入，总结查阅的文献，目前已知的途径有四种：

A死亡受体通路：又称细胞外通路或细胞膜途径。由死亡配体（如TNFα，FasL，TWEAK，TRAIL）与对应的死亡受体（TNFR，Fas，DR3，DR4/DR5）结合后启动。此结合导致受体的三聚化，其胞内募集一些接头蛋白（如TRADD、FADD）及胱冬肽酶（caspase-8）酶原形成一种信号复合物，复合物中的caspase-8酶原通过自身的蛋白酶水解作用形成活性形式，然后它将启动caspase的级联反应，使caspase-3、-6、-7激活，这几种caspase可降解胞内结构蛋白和功能蛋白，最终导致细胞凋亡。此通路基本上不受bcl-2家族的影响。

B线粒体途径：又称细胞内通路。这条通路中细胞色素c的释放是细胞凋亡的关键步骤，释放到细胞质的细胞色素C在dATP存在的条件下能与凋亡相关因子1（Apaf-1）结合，使其形成多聚体，并促使caspase-9与其结合形成凋亡小体，caspase-9被激活，被激活的caspase-9能激活其他的caspase（如caspase-3等），从而诱导细胞凋亡。细胞色素C从线粒体释放的调节是细胞凋亡分子机制研究的关键问题。多数凋亡刺激因子通过线粒体激活细胞凋亡途径。Bcl-2基因蛋白家族在这条通路中起了重要的作用。

C颗粒酶B直接活化效应Caspase途径[1]。颗粒酶B（granzyme B）是CTL细胞的一个重要杀伤武器，它是已知唯一能够激活Caspase的非Ca sp a se酶。在CTL细胞的细胞毒效应中，Caspase成员受颗粒酶B激活，通过酶解级联反应，切割PARP，导致DNA片段化，终至细胞死亡。

D内质网途径：细胞凋亡中钙离子起了很重要的作用，在细胞凋亡过程中DNA的消化需要相关的Ca2+依赖性核酸内切酶的参与。内质网途径主要受caspase12调控，也受Bcl-2家族蛋白质的调控。

2 辐射诱导细胞凋亡的信号转导通路的研究

辐射可作用于细胞核和细胞膜，分别引起DNA损伤和神经酰胺的产生，DNA损伤和神经酰胺介导两种不同的凋亡信号转导通路[2]。

2.1 DNA损伤介导的凋亡信号转导通路

辐射导致的DNA损伤后，有3种酶被激活：毛细管扩张失调症突变激酶（ATM）、ATM相关激酶（ATR）和DNA依赖的蛋白激酶（DNA-PK）。电离辐射时，主要是ATM使p53第15位上丝氨酸残基磷酸化，破坏了p53-Mdm2的相互作用，取消了Mdm2对p53的抑制作用，导致p53稳定性和活性增强。p53激活以后又可通过线粒体和死亡受体两种不同的途径导致细胞凋亡[3]。

2.1.1.线粒体通路：p53上调Bax的表达，Bax转移到线粒体外膜上，诱导线粒体释放出促凋亡蛋白，如细胞色素C和凋亡诱导因子（AIF）等[4]，在ATP或dATP存在的情况下，细胞色素C与凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）相结合并促使Apaf-1形成寡聚体。由于Apaf-1与caspase-9前体之间具有同源结构域，通过蛋白质-蛋白质相互作用，Apaf-1募集胞浆中的caspase-9前体并以1∶1的比例与之结合，因此caspase-9前体也形成了聚合体。聚合的caspase-9前体通过自我活化产生了具有活性的caspase-9，caspase-9又活化caspase-3和caspase-7。活化caspase-3反过来又能激活caspase-9酶原，形成正反馈通路。caspase-3和caspase-7都是凋亡过程的主要水解酶，通过水解特异的蛋白底物而引起细胞凋亡[5]。活化的caspases反过来也可直接作用于线粒体外膜，引起外膜通透性增强，有利于细胞色素C释放。

2.1.2.死亡受体通路：电离辐射可通过p53依赖的方式誘导死亡受体Fas及其配体Fas L（即CD95 L或CD178）的表达。p53增强Fas基因的转录，肿瘤细胞受到电离辐射后Fas L表达增强[6]FAS/FASL系统激活后通过死亡途径介导凋亡。

2.2神经酰胺介导的凋亡信号转导通路

辐射作用于细胞膜受体（如Fas受体和TNFα受体等），死亡受体聚合除了可以激活死亡受体凋亡通路以外，还可以激活酸性/中性鞘磷脂酶，产生神经酰胺[7]。另外，神经酰胺的产生途径还有：①激活神经酰胺合成酶，从头合成神经酰胺；②辐射直接裂解鞘磷脂产生神经酰胺[8]。神经酰胺是一种重要的第2信使，介导细胞的增殖、分化、生长抑制和凋亡等，其生物活性的多样性与细胞类型有关[9]。神经酰胺主要通过激活MAPK信号通路和抑制Akt/PKB信号通路协同作用诱导细胞凋亡。

3 胆管癌细胞凋亡与Fas/FasL

3.1Fas/FasL研究现状

3.1.1 Fas/FasL的结构与功能

Fas又称Apo-1或CD95分子，属于肿瘤坏死因子/神经生长因子受体家族成员。Fas基因定位于人染色体10q23，其编码产物为相对分子质量45×103的Ⅰ型跨膜蛋白，由胞外区（157aa）、穿膜区（17aa）及胞浆区（145aa）组成。Fas的天然配体FasL（Fasligand），属于肿瘤坏死因子/神经生长因子超家族成员，在体内主要以膜结合形式存在，定位于人染色体1q23，其基因的编码产物为相对分子质量40×103的Ⅱ型跨膜蛋白。Fas/FasL结合是激活体内Fas凋亡信号的惟一有效途径。Fas/FasL介导的凋亡，在生物体内有重要的生理功能：①参与克隆选择，使与自身抗原发生反应的T细胞凋亡；②介导细胞毒作用，杀伤靶细胞；③激活细胞诱导死亡（activation-inducedcell death，AICD）；④免疫赦免的形成，使眼、睾丸等器官免受免疫系统的攻击；⑤参与免疫耐受的形成

3.1.2 Fas/FasL信号转导通路 Fas-FasL结合触发多个不同的路径，并涉及半胱氨酸蛋白酶系列（caspases）错综复杂的相互作用。目前认为至少有4个信号转导路径，包括2个主要途径和2个其它途径。

3.1.2.1 主要途径一：受CD95L刺激，CD95发生微聚化，通过同种蛋白相互作用，CD95诱导含死亡域（DD）的接头蛋白FADD（Fas-associated death domain聚合，FADD利用其另一结构域DED募集含DED的caspase-8，c-FLIP，caspase-10，形成死亡诱导信号复合体（DISC），在DISC上出现大量活化的caspase-8，足以切割caspase-3，细胞呈现典型的凋亡形态学改变，此过程不需要线粒体参与。，Fas信号转导又分成两个不同的分枝路径，这两个途径都依赖caspase-8的激活。一个分枝途径直接引起其它caspases的一连串的水解活化。另一个分枝途径称脂质途径，包括鞘磷脂水解和神经酰胺积聚。以上Fas/FasL信号转导路径的特点是需要足够量的DISC，通过caspase-8的活化直接激活下游效应因子caspase-3，caspase-6和caspase-7。具有这些Fas信号转导特征的细胞称为Ⅰ型细胞[11，12，13]

3.1.2.2主要途径二：Fas-FasL相互作用后，细胞内没有形成足够量的DISC，caspase-8活化少，不足以切割caspase-3，它可能受凋亡抑制蛋白（IAP）保护，但此少量的caspase-8却能切割胞浆中只含BH3结构域的Bcl-2家族成员Bid（Bcl-2 interacting domain）蛋白，产生的tBid移位到线粒体，诱导线粒体损伤，线粒体内促凋亡蛋白释放，增强了凋亡信号，最终活化下游caspase-9，此过程必须依赖线粒体作用[10]。这一Fas/FasL信号转导路径的特点是caspase-9的激活发生在线粒体膜电位的变化之后，最后激活的caspase-9激活下游效应因子caspase-3，caspase-6和caspase-7。具有这些Fas信号转导特征的细胞称为Ⅱ型细胞[12，13，14]。

3.1.2.3 其它途径一：Fas与FasL有效结合后，通过另一接头分子-受体作用蛋白（RIP）（一种丝氨酸/苏氨酸激酶）与RAIDD [RIP-associating IL-1βconverting-enzyme-like protease 1 （ICH-1）-homologous DD]和caspase-2（ICH-1）形成一复合物，转导Fas信号，并且不依赖caspase-8的激活。

3.1.2.4 其它途径二：此途径是由另外一种Fas相关蛋白死亡结构域相关蛋白（DAXX）与凋亡信号调节激酶1（ASK1）形成复合物，热休克蛋白Hsp27可抑制此复合物的形成[14～17]，然后此复合物激活c-JNK（c-Jun N-terminalkinase）和丝裂原，活化蛋白激酶p38，活化的p38激活caspases有关蛋白的基因转录。

3.2 FAS/FASL在胆管癌细胞的表达及意义

随着分子生物学技术的发展，已初步了解胆管癌发生的相关因素与步骤。Fas/FasL系统的失调导致胆管癌细胞凋亡障碍并产生免疫逃逸，在胆管癌发生、发展及转移中起着重要作用。有研究表明人肝门部胆管癌表达具有功能的FasL，因而胆管癌可通过FasL的表达来反击人体免疫系统、获得免疫赦免以助于其恶性生长。由此看来，“Fas-反击”可能是人肝门部胆管癌免疫逃逸的一潜在的关键性的机制。而有些研究表明胆管癌同样表达FAS，但却没有介导细胞凋亡，即出现所谓的FAS/FASL抵抗，究其原因可能有以下几方面：1.Fas受体的因素即受体的质和量异常，胆管癌细胞不表达、低表达FAS抗原或表达无功能FAS[18-20]，亦或发生基因突变或呈可溶性分泌形式sFas，可以中和FASL间接抑制凋亡。2.FAS信号传导途径缺陷。表现为FADD等低表达或功能障碍、caspase-8点突变，caspase-1下调[21，22]，FLIPs阻断FADD与pro-Caspase-8的作用，进而阻断FAS受体的下游信号传导。3.胆管癌细胞中还可能存在抑癌基因突变以及癌基因的协同作用[23]，如P53的突變导致FAS损伤，c-myc基因表达上调导致肿瘤通过FAS抵抗而得以恶化。4.胆管癌组织表达BCL-XL MCL-1 可阻断FAS介导的凋亡。

3.3 FAS/FASL对诱导胆管癌细胞凋亡的调控

有研究[24，25，26]表明，射线照射可诱发鼠胸腺细胞及脾脏T、B细胞凋亡，并伴有Fas表达明显升高。表明辐射导致或诱发了Fas介导的细胞凋亡。而在为数不多的研究文献中，也发现辐射也可诱导胆管癌细胞凋亡，并也伴有FAS的表达升高。FAS/FASL系统可通过多种途径介导凋亡，但在辐射诱导胆管癌细胞凋亡的过程中主要是通过哪种途径介导的，目前没有相关研究。FAS/FASL系统介导凋亡的过程中也受到多种抑制因子的调控。也就是说并不是所有表达FAS的胆管癌细胞系都对抗Fas抗体敏感。这些抑制因子包括SFAS、DcR3（decoy receptor 3，与Fas竞争结合FasL），FAP-1（fas-associated phosphatase-1具有与Fas细胞内结构域相互作用的能力，终止Fas诱导的凋亡），凋亡抑制剂蛋白IAPs

（inhibitors of apoptosis可与caspase-3，caspase-7，caspase-9的结合并抑制其活性），Bcl-2和Bcl-XL过表达可阻止线粒体释放细胞色素C，从而保护Fas凋亡中的线粒体，等等。这也许可以解释胆管癌对放疗敏感差，但目前对于这些抑制因子在辐射诱导胆管癌凋亡过程中的表达水平没有相关报道。由上可看出，Fas介导敏感性胆管癌细胞死亡必须具备至少三个条件：①细胞表面的Fas受体增加，②Fas与其广泛交联的特异性配体结合促进Fas受体帽的形成，③胞内凋亡拮抗蛋白（如Fap-1）的移除。

4 结语

胆管癌无论从早期诊断还是治疗上都非常棘手，随着细胞凋亡研究的不断深入，为胆管癌的诊治带来了希望。通过各种化学药物或局部辐射诱导胆管癌细胞凋亡已成为研究热点。但其中许多机制尚不清楚。如辐射诱导胆管癌细胞凋亡中FAS/FASL如何参与凋亡调控目前还没有太多研究。辐射诱导胆管癌细胞凋亡的过程中FAS/FASL主要是通过哪种途径介导的，胆管癌细胞是属于I型还是II型细胞，辐射是否可以激活胆管癌细胞膜表面其他受体途径，如TNFR-2-NFκB轴的活化，该轴可抑制凋亡，促进细胞增殖，如有激活这两者之间是如何相互调控的。Caspase众多底物中哪些对诱导胆管癌细胞凋亡有调控作用等等。故弄清辐射诱导胆管癌细胞凋亡中Fas/Fasl的调控机制有助于发现肿瘤治疗的新方法，为胆管癌的治疗提供更多的出路。

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