LPS致肝细胞损伤模型的建立研究

滕芳芳　胡晓斐　刘晨晨等

摘要[目的]探索LPS体外致人Chang Liver细胞损伤模型的建立方法和意义。[方法] 分别用20、40、60、80、100 μg/ml浓度的LPS作用Chang Liver细胞24 h，采用MTT法检测LPS对Chang Liver细胞存活率的影响，分别测定Chang Liver细胞上清中谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰转肽酶（γGT）、乳酸脱氢酶（LDH）的活性，并通过Hoechst 33258荧光染色观察用药24 h后Chang Liver 细胞形态的变化。[结果] 80和100 μg/ml浓度的LPS作用后Chang Liver细胞存活率显著性降低， 胞外AST、ALT、ALP、γGT、LDH酶活性升高，细胞数目减少，细胞形态发生改变，呈现细胞核固缩等细胞凋亡现象。[结论] 用80 μg/ml的LPS与Chang Liver细胞共培养24 h，可以建立理想的体外肝细胞损伤模型。

关键词LPS； Chang Liver细胞； AST； ALT； Hoechst 33258

中图分类号S986.2文献标识码A文章编号0517-6611（2014）04-01071-03

基金项目国家自然科学基金面上项目（81273429）；浙江省科技厅重大专项（2013C03036，2011C02003，2011C23034）；舟山市科技计划项目（2012C23023）。

作者简介滕芳芳（1989- ），女，浙江舟山人，硕士研究生，研究方向：海洋功能食品、海洋药物。*通讯作者，教授，硕士生导师，从事海洋功能食品和海洋药物研究。

脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁外膜的成分，其主要是由亲水的多糖和疏水的类脂A组成。LPS可诱导多种细胞凋亡造成多种细胞损伤，如巨噬细胞RAW264.7、人小肺癌细胞NCLH446、神经细胞PC12、人子宫颈癌传代细胞Hela cell等[14]。

不同的诱因导致不同的慢性肝病，有病毒性肝炎、成药物性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、自身免疫性肝病等均能造成肝细胞损伤[5-6]，肝细胞损伤是肝病的共同病理基础，是不同肝病的共同表现。因此，建立一个稳定的肝细胞损伤模型，开展对肝细胞损伤机制的研究，有利于保肝机制的基础研究。研究表明，LPS适合作为诱导肝损伤模型的药物，特别是体内LPS损伤建模已比较成熟，Debolina Nandi等用5 mg/只LPS剂量作用瑞士小鼠[7]。刘小伟等用4 mg/kg LPS剂量作用Balb/c小鼠[8]，成功建立了小鼠肝损伤模型。LPS虽多用于体内建模的诱导剂，也可作为诱导肝细胞凋亡，但关于LPS对体外肝细胞损伤的诱导剂量尚未见报道。因此，笔者采用不同浓度LPS诱导肝细胞损伤，检测上清液中肝损伤指标酶活性变化，并观察诱导后肝细胞的形态变化，从而初步建立一个LPS诱导的稳定体外肝细胞损伤模型。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象。正常人肝细胞：张氏肝细胞（Chang Liver）购自中南大学湘雅医学院细胞中心。

1.1.2主要试剂与设备。大肠杆菌脂多糖（0111：B4 LPS）、RPMI 1640、四氮唑蓝（MTT），均购自Sigma公司；丙酮酸钠购自国药集团化学试剂有限公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；AST、ALT、ALP、γGT、LDH试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所； Hoechest 33258染料购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养。人正常肝Chang Liver细胞，用含 10%胎牛血清，加入有双抗溶液（青霉素 G100 IU/ml、链霉素 100 IU/ml）、0.11 g/L丙酮酸钠的 RPMI 1640 培养基，于 37 ℃、5% CO2培养箱中培养至对数生长期。

1.2.2MTT法。采用MTT法进行检测。取对数生长期的Chang Liver细胞制成悬液，接种至96孔板，每孔200 μl，于37 ℃、5% CO2培养箱中贴壁5 h，再加入不同浓度的LPS（20、40、60、80、100 μg/ml），每个浓度设5个平行孔，同时设立不加样品的对照组，置37 ℃、5% CO2培养箱中孵育，培养结束加入180 μl PBS 和20 μl MTT继续培养4 h，再用150 μl的DMSO溶解。置于酶标仪490 nm处测定吸光度，OD值大小与活细胞成正比，每孔的实际OD值等于实测的OD值减去空白OD值。

1.2.3细胞上清液中谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、γ谷氨酰转肽酶（γGT）、乳酸脱氢酶（LDH）的活性检测。取对数生长期的人正常肝细胞制成悬液，接种至6孔板，每孔2 ml于37 ℃、5% CO2培养箱中贴壁培养至细胞达到70%～80%，加入不同浓度的LPS，每个浓度设置3个复孔，同时设立不加样品的对照组，24 h后取上清液使用试剂盒检测其中AST、ALT、ALP、γGT和LDH的活性。

1.2.4细胞形態学观察。取对数生长期的Chang Liver细胞制成悬液，接种于有预处理盖玻片的6孔板，每孔2 ml于37 ℃、5% CO2培养箱中贴壁培养24 h，制备细胞爬片，达到70% ～80%融合时去除培养液，加入不同浓度的LPS，同时设立不加样品的对照组，培养24 h后，弃去培养液后加入4%的多聚甲醛固定细胞15 min，再弃去上清加入200 μl/孔的Hoechest 33258染料溶液，在37 ℃培养10～20 min，然后用PBS液（pH 7.4）洗涤细胞2次，置于荧光显微镜下观察Chang Liver细胞生长情况及诱导前后形态学变化。

1.3数据统计与分析采用 SPSS 18.0 统计软件处理数据，结果均以±s表示，组间差异采用oneway ANOVA分析，以P<0.05表示差异显著，有统计学意义。

2结果与分析

2.1不同浓度LPS对Chang Liver 细胞活性的影响在MTT试验中，由于酶标仪测出的实际OD值与活细胞数成正比，可以用来反映细胞损伤情况。从图1可以看出，LPS作用24 h以后，随着LPS浓度的增加，OD值逐渐下降，且浓度

注：*表示與阴性对照组差异显著（P<0.05）。

2.2不同浓度LPS对Chang Liver细胞培养上清液中AST、ALT、ALP、γGT、LDH活性的影响由表1可知，不同浓度LPS诱导Chang Liver细胞后，随着药物浓度的增加AST、ALT、ALP、γGT、LDH在细胞外的浓度均随着给药浓度的增加而增加，细胞损伤程度随浓度增加而加重。其中，60 μg/ml LPS组培养液中ALP、γGT活性与阴性对照组有显著差异（P<0.05），80和100 μg/ml组培养液中AST、ALT、ALP、γGT、LDH活性与阴性对照组比较均有显著性差异（P<0.05）。

2.3不同浓度LPS对Chang Liver细胞形态的影响通过MTT和活性试验可以看出，LPS作用Chang Liver细胞已出现损伤，再进一步的细胞形态学观察，可更直观地看到用LPS诱导后的细胞变化情况。从图2可以看出，在200倍荧光显微镜下观察，LPS诱导24 h后对照组细胞呈均匀的蓝色荧光，细胞贴壁良好且呈上皮样舒展。随着LPS浓度的增加，细胞损伤变重。当LPS浓度为80 μg/ml时，细胞出现空泡化等细胞早期凋亡现象。当LPS浓度为100 μg/ml时细胞数目明显减少，同时细胞出现细胞核固缩、碎裂等细胞晚期凋亡现象。

3结论与讨论

LPS也称为内毒素，是常见的肝损伤诱导剂。与其他的肝损伤模型（如四氯化碳、D半乳糖胺、乙醇等）相比，LPS尤其是与卡介苗联合作用建立的肝损伤动物模型，因其造成的肝炎病变活动（肝细胞的凋亡、坏死，肝内细胞外基质过分沉积，大量炎细胞浸润[9]）类似于人体慢性肝炎病变过程，因此该动物模型更是研究慢性肝病的发病机制与筛选保肝药物的较理想模型之一[10-11]。细胞凋亡是重症肝炎特别是病毒性肝炎发病时的特征性变化，是肝损伤的早期变化之一。研究表明LPS直接作用正常肝细胞后，肝细胞受损的原因之一就是LPS诱发了肝细胞凋亡[12-13]。因此，LPS是合适的体外肝细胞损伤模型的诱导剂，但关于LPS的作用浓度报道较少。

用LPS作用体外稳定的肝细胞系Chang Liver细胞系，探讨LPS作用浓度，建立体外肝细胞损伤模型，为下一步筛选保肝药物的成分和浓度及其保肝机制奠定试验基础。经LPS作用后，肝细胞损伤明显，尤其是80和100 μg/ml LPS浓度作用Chang Liver细胞时，活细胞数目显著降低（P<0.05）。在正常情况下，肝细胞的关键性酶AST、ALT位于肝细胞内的线粒体中，其浓度远远大于其在血清中的含量，是肝细胞损伤的敏感指标之一。当肝细胞受到损伤时，细胞膜的通透性发生改变，胞内的AST、ALT被大量释放到细胞外。此外，肝细胞内还存在大量的ALP、LDH、γGT，当在细胞培养液中被大量检测时，也说明肝细胞膜通透性改变。在该试验中用80和100 μg/ml的LPS作用Chang Liver细胞后细胞培养液中的AST、ALT浓度显著性增加（P<0.05）。随着LPS浓度的增加，细胞培养液中的ALP浓度增高，γGT、LDH被大量释放到细胞外，说明Chang Liver细胞膜通透性改变。同时，观察到Chang Liver细胞形态也发生了较大的改变，正常细胞呈上皮样舒展、贴壁良好，当LPS浓度为80 μg/ml时细胞出现空泡化等早期凋亡现象。当LPS浓度为100 μg/ml时细胞数目明显减少同时细胞出现细胞核固缩、碎裂等细胞晚期凋亡现象。据此推测，LPS浓度为80 μg/ml是比较合适的诱导剂量。当LPS浓度小于80 μg/ml时细胞活性较好，胞内的关键酶也没有被大量释放，细胞形态学改变也较不明显。当LPS浓度为80 μg/ml时虽有损伤，但细胞膜相对较为完整，细胞仍具有一定活性，而LPS浓度为100 μg/ml作用Chang Liver细胞后细胞已处于凋亡晚期，损伤已不可修复。注：A.对照组；B、C、D、E、F组为药物组（LPS浓度分别为20、40、60、80和100 μg/ml）。

图2不同浓度LPS作用Chang Liver细胞后的形态变化 （×200）综上所述，用浓度80 μg/ml的LPS与Chang Liver细胞共培养24 h，可以建立理想的体外肝细胞损伤模型，为进一步研究海洋活性肽对肝细胞保护的药物筛选研究奠定试验模型基础，具有较高的应用价值。

参考文献

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