H PLC指纹图谱法测定不同粉碎度野山花旗参粉末中人参皂苷含量

卓丹如 钱丽萍 章宁 林绥 阙慧卿 林善财

（1福州瑞来春堂生物科技有限公司，福建福州350007；2福建省医学科学研究院药物所，350001）

H PLC指纹图谱法测定不同粉碎度野山花旗参粉末中人参皂苷含量

卓丹如1钱丽萍2章宁1林绥2阙慧卿2林善财1

（1福州瑞来春堂生物科技有限公司，福建福州350007；2福建省医学科学研究院药物所，350001）

目的：建立高效液相色谱法（HPLC）指纹图谱法，测定野山花旗参100目、200目、1 000目粉三种粉末中人参皂苷Re、Rb1、Rg1的总含量，通过指纹图谱相似度比较，考察粉碎对野山花旗参中人参皂苷的影响。方法：采用梯度洗脱、HPLC测定三种粒径粉末的HPLC指纹图谱，计算主要药效成分人参皂苷Re、Rb1、Rg1的含量，并进行比较，通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”评价三个样品的相似度。结果：野山花旗参100目、200目、1 000目粉的主要有效成分人参皂苷Re、Rb1、Rg1的总含量均大于3.96%，三种粉末的指纹图谱重叠率高，共有峰的相对保留时间吻合，与生成的对照指纹图谱相似度分别为0.946，0.979，0.970。结论：野山花旗参100目、200目与1 000目粉的HPLC指纹图谱相似度大于0.946，化学成分的种类没有变化，主要有效成分人参皂苷Re、Rb1、Rg1的总含量基本相等，野山花旗参超微粉碎成1 000目粉，化学成分保持不变。

野山花旗参粉末；粉碎度；人参皂苷；HPLC指纹图谱；相似度

花旗参为五加科人参属植物西洋参的俗名，主产在美国和加拿大，药用部分为干燥的根[1]。具有抗疲劳、抗缺氧、抗癌、抗衰老等作用，可增强机体耐缺氧能力，保护心脏；具有增强学习与记忆的功能，还具有防治动脉粥样硬化、调节血脂代谢等药理作用[2]。野山花旗参属于贵重的滋补良品，常采用粉末口服给药，粉末的粒径与其有效成分的溶出度和溶出速率有直接的关系，因此采用适宜的加工工艺，保存有效成分，提高生物利用度具有积极的意义。杨连威等[3]认为中药超微粉碎后可提高药物中有效组分的溶出率，增大药物的生物利用度，有利于保存生物活性成分，节省药材，降低药物用量等优点。前期实验采用超纯水为溶出介质，考察同批号的3种野山花旗参粉（100目、200目、1 000目粉），发现野山花旗参超微粉（1 000目粉）的人参皂苷Rb1溶出迅速，溶出曲线平稳，超微粉碎有利于人参皂苷Rb1的溶出[4]。

色谱指纹图谱相似度用于中药质量稳定性的评价，简单易行，易于推广，是中药质量控制的重要手段。色谱指纹图谱相似度可用于中药材的品种鉴别及中药生产中原料、中间体和产品的质量控制，不同的质量控制环节应选择合适的相似度方法以及针对不同的中药对象选用合适的相似度方法是中药质量评价中的一个关键问题[5]。本实验应用高效液相色谱法（HPLC）测定野山花旗参100目、200目和1 000目粉的总皂苷含量，建立野山花旗参粉指纹图谱分析方法，并采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》评价3种粒径粉末的化学成分种类及含量变化，考察超微粉碎后野山花旗参粉的物质基础变化情况，提高野山花旗参的生物利用度，为野山花旗参粉的质量控制提供积极作用。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AT岛津高效液相色谱仪（日本），AL-204电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司），水浴锅（上海申生科技有限公司）。

1.2 药品与试剂

人参皂苷Re对照品（购自原中国药品生物制品检定所，批号：110754-200822），人参皂苷Rb1对照品（购自原中国药品生物制品检定所，批号：110704-201122），人参皂苷Rg1对照品（购自原中国药品生物制品检定所，批号：110703-201027），野山花旗参100目粉（细粉），200目粉（极细粉），1 000目粉（超细粉）（由福州瑞来春堂生物科技有限公司提供，原产地：美国，批号Y03120901），正丁醇（西陇化工股份有限公司）、无水乙醇（西陇化工股份有限公司），甲醇（色谱纯），乙腈（色谱纯），磷酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），超纯水（自制）。

2 实验方法

2.1 色谱条件[1]

色谱柱：十八烷基键合硅胶为填充剂；柱温：室温；流速：1.0 m L/m in；检测波长：203 nm；进样量：20 μL，流动相：A水，B乙腈，按表1进行梯度洗脱。

表1 流动相比例

2.2 对照品溶液的制备

精密称取人参皂苷Re、Rb1、Rg1适量于量瓶中，加甲醇制成每1 m L各含人参皂苷Re 0.69 mg，人参皂苷Rb11.08 mg，人参皂苷Rg10.19 mg的溶液，备用。

2.3供试品溶液的制备

取各种粉末约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水饱和的正丁醇50 m L，称定重量，置水浴中加热回流提取1.5 h，放冷，再称定重量，用水饱和正丁醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25 m L，置蒸发皿中，蒸发，残渣加50%甲醇适量使溶解，转移至量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 系统适应性实验

将上述对照品溶液和供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，结果表明，供试品与对照品在相同的保留时间内出现吸收峰，峰形较好，理论塔板数大于8 000，各杂质峰无干扰，达到了较好的分离效果。

2.5 精密度试验

精密吸取对照品溶液20 μL，按上述色谱条件，连续重复进样5次，测定峰面积，求得人参皂苷Re、Rb1、Rg1的RSD分别为0.92%，1.05%，0.88%（n=5）。表明精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一份样品溶液（野山花旗参100目粉1号提取液），在0，1，2，4，8，24 h取20 μL注入高效液相色谱仪，测定人参皂苷Re、Rb1、Rg1的峰面积，计算人参皂苷的总含量，结果其相对偏差RSD分别为1.32%，1.45%，1.08%，表明样品放置24 h，人参皂苷Re、Rb1、Rg13种成分稳定。

2.7 重现性试验

取同一个供试品（野山花旗参100目粉1号提取液），按上述条件平行提取并测定6次，结果人参皂苷Re、Rb1、Rg1的RSD分别为1.055%，1.38%，1.42%，表明该方法重现性良好。

2.8 回收率实验

精密量取已知含量的提取液（野山花旗参100目粉1号提取液）适量，精密加入相应比例的人参皂苷Re、Rb1、Rg1对照品，提取并测定，计算回收率，人参皂苷Re、Rb1、Rg1的平均回收率分别为99.6%，101.05%，98.76%。RSD分别为1.57%，0.94%，1.09%（n=6）。

2.9 含量测定

精密吸取对照品溶液、供试品溶液20 μL注入高效液相色谱仪，采用梯度洗脱法测定峰面积，计算各供试品人参皂苷Re、Rb1、Rg1的含量，色谱图见图1，含量结果如表1。并通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”比较四个样品峰面积的细微差别，见图2，计算相似度如表2。

图1 野山花旗参不同粉碎度粉末HPLC图

表2 三种不同粒径样品中人参皂苷Re、Rb1、Rg1平均值的总含量表

3 结果

通过对3种野山花旗参粉末中人参皂苷Re、Rb1、Rg1总量的测定，发现野山花旗参粉碎成200目与1 000目粉后，人参皂苷Re、Rb1、Rg1的总含量高于3.91%，均大于国家药典规定的2.0%。

图2 3种野山花旗参粉指纹图谱对比

表2 3种野山花旗参粉相似度比较

从3种野山花旗参粉指纹图谱中选取8个共有指纹峰，采用国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2004A版）对野山花旗参100目、200目、1 000目粉的指纹图谱进行分析，生成对照图谱和共有模式图，3种粉末的8个共有峰相对保留时间吻合，相对峰面积波动不大，重叠率极高。以200目粉的指纹图谱为对照，100目粉的相似度为0.87，1 000目粉的相似度为0.973；3种粉末与生成对照指纹图谱的相似度分别为0.946，0.979，0.97，说明3种粉末相关性良好。通过与混合人参皂苷对照品色谱图对比，指认共有峰1、2、3分别为Re、Rb1、Rg1对照品色谱峰。表明野山花旗参粉碎成不同粒径后，所含化学成分种类相似度较高，含量方面存在细微差异。

4 讨论

西洋参具有滋补强壮、养血生精、宁神益智的功效，其主要药效成分为人参总皂苷[6]，花旗参为五加科人参属植物西洋参的俗称，因主产于美国和加拿大而得名。本研究所用花旗参为美国产纯天然野生品种，所受污染少，生长年限长，因此，其所含药效成分如人参皂苷Re、Rb1、Rg1等通常远高于栽培品种，属于贵重保健品，通过物理或化学方法保存野山花旗参的生物活性，增大溶出度，提高其生物利用度具有重要的意义。

前期实验采用超纯水为溶出介质，考察同批号3种不同粒径的野山花旗参粉，发现在溶出开始的前10 m in，极细粉（200目）的人参皂苷Rb1溶出率稍微大于细粉（100目），细粉又稍大于超微粉（1 000目），10 min以后，超微粉、极细粉和细粉的润湿度慢慢接近，因为超微粉与溶出介质的接触面大于细粉和极细粉，所以溶出率迅速升高并达到平衡，而细粉和极细粉在90 m in内溶出率呈缓慢上升趋势。超微粉碎有利于野山花旗参人参皂苷Rb1的溶出[4]。本研究根据《中国药典》2010年版规定，梯度洗脱样品，测定人参皂苷Re、Rb1、Rg1的总含量，应用中药色谱指纹图谱相似度评价系统评价3种粉末，发现同批号野山花旗参粉碎成不同粒径后，主要有效成分人参皂苷Re、Rb1、Rg1总量基本保持不变，3种粉末指纹图谱相似度大于0.946，推测3种粉末中化学成分相似，粉碎前后物质基础没有改变。结合前期的研究[4]，得知超微粉碎可提高野山花旗参的生物利用度，提高资源利用率。

超微粉碎技术可提高人参皂苷Re、Rb1、Rg1的生物利用度，但野山花旗参作为贵重保健品，营养成分十分丰富，越细的粉末对存放条件的要求越高。因此，要保证超微粉碎技术在野山花旗参加工方面的绝对优势，药材超微粉碎后应迅速灭菌隔氧密封保存，以增加稳定性，提高超微粉的质量。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（2010年版）一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：122-123.

[2]王筠默.西洋参药理作用研究的最新进展[J].中药药理与临床，2001，17（4）：46-48.

[3]杨连威，赵晓燕，李婷，等.中药超微粉碎后对其性能的影响研究[J].世界科学技术—中医药现代化，10（6）：77-81.

[4]卓丹如，阙慧卿，章宁，等.不同粉碎度野生西洋参人参皂苷Rb1的体外溶出度研究[J].药物评价研究，2013，36（5）：374-376.

[5]詹雪艳，林兆洲，段天璇，等.色谱指纹图谱相似度方法的适应性研究[J].中国中医药信息杂志，2012，19（5）：61-64.

[6]王蕾，王英平，许世全，等.西洋参化学成分及药理活性研究进展[J].特产研究，2007，29（3）：73-77.

Content Determ ination of Ginseng Saponins of wild American Ginseng Powder in Different Crushing Degree by HPLC Fingerprint

Zhuo Danru1，Qian Liping2，Zhan Ning1，Lin Sui2，Que Huiqing2，Lin Shancai1（1 Fuzhou Ruilaichuntang Biological Technology Co.，Ltd.，Fujian Fuzhou 350007，China；2 Instituteof Medical Sciencesof Fujian Province，350001）

Objective:To establish a HPLC fingerprintmethod for the determ ination of the total content of Re，Rb1and Rg1in ginseng saponins of the wild American ginseng powder（100，200 and 1 000 mesh powder).To investigate the crushing effect on ginseng saponins of wild American ginseng by comparing the sim ilarity of HPLC fingerprints.M ethods: Using HPLC and gradient elution，the fingerprints of three kinds of particle size of powders were determ ined，and the contents of themain effective components of Re，Rb1，Rg1in ginseng saponin were calculated and compared.Through the Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM，the similarity of the three samples was evaluated.Results:As themain active ingredientsof wild American ginseng，the contentsof Re，Rb1，Rg1of ginseng saponinwere all greater than 3.96%in the powder of 100，200 and 1 000 mesh，the fingerprint overlap rate of three kinds of powders was high，the relative retention time of the common peak was matched，and the generated fingerprint sim ilarity to the control was0.946，0.979 and 0.970 respectively.Conclusion：The HPLC fingerprintsimilarity of wild American ginseng（100，200 and 1 000 mesh powder）was greater than 0.946，the chemical composition of the species was not changed，the contents of Re，Rb1，Rg1of ginseng saponin as the main active ingredients were generally the same，and when wild American ginsengwasgrinded into 1 000mesh powder，the chemical components remained the same.

Wild American Ginseng Powder;Crushing Degree；Ginseng Saponins；HPLC Fingerprint；Similarity

10.3969/j.issn.1672-5433.2014.08.005

2014-06-16）

卓丹如，女，药师。研究方向：中药生产和产品质量管理。E-mail：532056077@qq.com

阙慧卿，女，助理研究员。研究方向：中药与天然药物化学。通讯作者E-mail：284978108@qq.com