不同高温处理工艺对C／C复合材料生物相容性的影响

倪昕晔，李爱军，钟 萍，林 涛，熊信柏，顾卫东

（1上海大学 材料科学与工程学院，上海200444；2南京医科大学 附属常州第二人民医院，江苏 常州213003；3南京航空航天大学 材料科学与技术学院，南京210016；4深圳大学 材料学院，广东 深圳518060）

碳是组成有机物质的主要元素之一，更是构成人体的重要元素［1］，碳材料已在心脏瓣膜、骨骼、齿根、血管、肌腱等诸多人工材料方面获得应用和发展。C／C复合材料克服了单一碳材料的脆性，具有高强度、高韧性、耐腐蚀、耐高温等优点［2，3］，C／C复合材料是以炭纤维增强炭基体的新型复合材料，是一种极有潜力的新型生物医用材料。C／C复合材料弹性模量与人骨相当，是具有良好应用前景的人工关节、骨假体材料［4］，过去常关注的是C／C复合材料表面炭颗粒的脱落和表面改性［5－8］，但国内外对于医用C／C复合材料制备的报道较少，从采购原材料到生产C／C复合材料整个过程未能严格按照医用标准，目前C／C复合材料大多来源于航空航天领域［9］，含有各种杂质甚至有毒元素，如何在制备过程中消除或减少有毒元素从而使C／C复合材料生物相容性较好，是生物材料领域遇到的难题之一。过去对C／C复合材料的毒性进行了研究，一般认为毒性较小或无毒［10］，这可能与实验材料的选取、实验方法有关，过去评价生物相容性常用的方法是细胞在植入物浸提液环境中培养，而不是直接在植入物表面培养［11］。本研究通过不同工艺化学气相浸渗法（Chemical Vapor Infiltration，CVI）制备含有不同成分的C／C复合材料，来分析在其表面人颅骨成骨细胞的生长情况。这种利用C／C复合材料耐高温特点来延长高温处理时间，以减少或去除C／C复合材料的有毒物质未见相关报道。

1 实验

1.1 C／C复合材料制备及成分检测

通过CVI方法制备2.5维PAN基的C／C复合材料，预制体原始基体密度为0.5g／cm3，把碳氢化合物气体通入CVI炉中，制得1.3g／cm3的C／C复合材料，经2800～3200℃石墨化处理4h。在此基础上继续热解炭沉积，制得密度为1.5g／cm3的C／C复合材料，再石墨化处理4h。进一步热解炭沉积，得到1.7g／cm3的C／C复合材料，再石墨化处理4h或8h。

制备得到密度分别为1.3，1.5，1.7g／cm3的 C／C复合材料，其中1.7g／cm3的C／C复合材料分为两种不同热处理时间得到的材料。材料高温石墨化累计时间分 别 为 4（1.3g／cm3），8（1.5g／cm3），12（1.7g／cm3），16（1.7g／cm3）h。将4种 C／C复合材料切割成10mm×10mm×2mm的植入样品各24个，表面用360＃，600＃，1200＃砂纸依次进行打磨，以消除材料密度差异引起的表面粗糙度对成骨细胞生长的影响［4］，依次用无水乙醇、双蒸馏水进行超声清洗3次，再进行高温消毒。

用Vista－AX型等离子体发射光谱仪对这4种C／C复合材料进行成分检测。

1.2 成骨细胞增殖实验

把C／C复合材料放入24孔细胞培养板中，每孔加入含有2×104个／m L的人颅骨成骨细胞的培养基1m L，培养基为RPMI1640和DMEM混合液，让细胞自然沉落在C／C复合材料表面，5h后吸取培养基，将PBS加入每孔中，并清洗C／C复合材料样品表面，再把表面黏附有成骨细胞的C／C复合材料移到新的24孔细胞培养板中，加培养基继续培养，分4个时间段进行观察，依次为2，4，6，8天进行比较。每个试验材料每个时间段有6块C／C复合材料，其中5块进行细胞计数，用胰酶把细胞从材料表面冲洗下来，并在PBS中重悬，采用九宫格细胞计数，测量每小格中的细胞数，再换算成每块材料表面总的细胞数，取平均值，用SPSS 11.0软件多组均数比较的方差分析各组细胞数之间的差异。另一块进行荧光显微镜观察，首先使用PBS清洗材料表面，体积分数10%甲醛室温进行固定15min，再用5μg／m L的碘化丙啶（PI，SIGMA 公司）进行荧光染色15min，最后用抗荧光淬灭液封片，采用OLYMLUSIX71型倒置荧光显微镜进行观察并拍摄照片。

2 结果与讨论

2.1 成分测量结果

用等离子体发射光谱仪对C／C复合材料检测，共检测了17种金属元素，分别是 Na，Mg，K，Ca，Mn，Fe，Cu，Zn，Ni，Pd，Ti，Al，Cr，Cd，Hg，Pb，As等，由于在4种材料中都没有发现Pd和Cu，故未在表1中标出。为了便于比较，将密度为1.3，1.5，1.7（12h），1.7g／cm3（16h）的C／C复合材料分别称为 A，B，C，D型C／C复合材料。通过比较 Na，Mg，Al，K，Ca，Ti，Cr，Mn，Fe，Ni，Cd，Hg等的含量大小依次为 A＞B＞C＞D，C，B，D材料不含有Zn，As，Pb；A，B材料 Hg的含量分别是C的12，15倍，是D材料的44，52倍；A，B材料Al的含量分别是C的5，20倍，是D材料的15，68倍；A，B材料Cd的含量分别是C和D的2，3倍。

表1 C／C复合材料杂质含量（mg·kg－1）Table 1 Impurities content of carbon／carbon composites（mg·kg－1）

2.2 成骨细胞增殖实验结果

图1 C／C复合材料表面细胞增殖数Fig.1 Cell proliferation number on the surface of carbon／carbon composites

成骨细胞在C，D复合材料表面生长良好，细胞数随着培养时间的延长而增加，符合细胞的生长规律；而成骨细胞在A，B复合材料表面生长状况差，如图1所示，在C，D材料表面，成骨细胞数量随着时间的延长而快速增长，到8天时细胞数量达到19500个左右。在A，B材料表面，成骨细胞数量在2，4天时增殖缓慢，在6天时A，B材料表面细胞数量只有150个左右，到8天时A，B材料表面细胞数量略有增加。

C，D与A，B的实验结果经SPSS11.0软件多组均数比较的方差分析，P＜0.05，有显著性差异，C与D结果之间，P＞0.05，无显著性差异。从荧光显微镜观察结果分析，第2天（见图2），C，D复合材料表面成骨细胞数量多，呈梭形形状，甚至能看到伪足的伸出，核染色明亮；B复合材料表面成骨细胞数量少，呈圆形，部分呈梭形，核染色不明亮；A复合材料表面成骨细胞数量少，形态呈圆形。第8天（见图3），C，D复合材料表面成骨细胞多，由于连成一片，因此不能清晰识别细胞的形状；B复合材料表面成骨细胞数量少，细胞体积大，大部分细胞形态呈圆形 ，一小部分细胞呈梭形；A复合材料表面成骨细胞细胞数量少，细胞体积大，形态呈圆形。

图2 C／C复合材料表面成骨细胞第2天荧光显微图（a）1.3g／cm3；（b）1.5g／cm3；（c）1.7g／cm3，12h；（d）1.7g／cm3，16hFig.2 Fluorescence microscopy map of osteoblasts on the surface of carbon／carbon composites in the second day（a）1.3g／cm3；（b）1.5g／cm3；（c）1.7g／cm3，12h；（d）1.7g／cm3，16h

2.3 讨论

成骨细胞在C复合材料生长良好，细胞数随着时间的延长而增加，符合细胞的生长规律，C与D表面的细胞增殖数量没有差异，而成骨细胞在A，B复合材料生长状况差。

由于在细胞增殖实验前对4种植入物表面进行了表面打磨处理，消除了粗糙度的影响因素，因此影响细胞增殖的只有C／C复合材料本身因素即微量元素含量。

图3 C／C复合材料表面成骨细胞第8天荧光显微图（a）1.3g／cm3；（b）1.5g／cm3；（c）1.7g／cm3，12h；（d）1.7g／cm3，16hFig.3 Fluorescence microscopy map of osteoblasts on the surface of carbon／carbon composites in the eighth day（a）1.3g／cm3；（b）1.5g／cm3；（c）1.7g／cm3，12h；（d）1.7g／cm3，16h

由表1可见，4种材料中Cu，Pd都没有检出，故不考虑其影响。在人体中元素的含量占体重质量分数0.01%以上的称为常量元素，Na，Mg，K，Ca等是常量元素，故不考虑其毒性。在人体中元素的含量占体重质量分数0.01%以下的称为微量元素，Fe，Mn，Zn，Ni，Cr等是人体必需微量元素，Fe，Mn，Zn，Ni在4种材料中的数量级较小，因此不考虑其对成骨细胞的毒性，Cr含量过高，会对机体和细胞产生毒性，Cr在水中通常以Cr6＋和Cr3＋两种形式存在，Cr3＋参与糖的代谢和防止人患冠状动脉粥样硬化症可能性，Cr6＋和Cr3＋过量摄入对人体都有害，过高的Cr3＋会明显抑制成骨细胞生长［12］，通常认为 Cr6＋危害更大，Cr6＋会穿过细胞膜还原成稳定的Cr3＋，同时产生四价、五价铬及产生强氧化作用，这些都会造成对细胞脱氧核糖核酸（DNA）的损伤［13］，影响细胞的增殖。Ti元素化学性质稳定，已证明其有优异的生物相容性。4种材料中Al，Cd，Hg，Pb，As等这些元素为人类非必须微量元素，有可能对成骨细胞造成毒性伤害。

Cd有致畸、致突变、致癌作用，Koizumi等认为Cd能使DNA损伤，引起DNA的单链断裂［14］。复旦大学钱海雷研究认为Cd直接作用于成骨细胞，使骨特异性碱性磷酸酶（b－ALP）显著下降，而这种磷酸酶对骨的矿化有重要的作用；同时研究还认为镉会影响胶原的代谢［15］。Hg可与细胞膜上的巯基结合，使细胞膜通透改变，引起细胞膜功能的障碍，从而影响生化反应和细胞功能；Hg还可作用于线粒体，使其释放细胞色素C等蛋白，与细胞质中的凋亡蛋白酶激活因子，从而诱导细胞凋亡。Pb进入人体后数周，主要沉积于骨骼和头发［16］，影响成骨细胞的钙磷代谢，Pb甚至可代替钙来激活钙通道，激活蛋白激酶，产生异常的钙信号，干扰细胞的功能；Pb可抑制碱性磷酸酶（ALP）的活性，影响成骨细胞的增殖［17］。As是一种细胞原浆毒，与含巯基的酶结合，使酶失去活性，影响细胞的生物氧化过程，从而干扰细胞能量代谢等。Al摄入过多，会沉积在骨中，通过钙化组织中的磷、钙以及与维生素D相互作用，干扰骨磷酸酶产生，从而抑制成骨细胞生长；Al还有很强的神经毒性、生殖毒性等［18］。胡晓磐等将 Hg，Cd，Pb联合染毒与单独染毒对比发现，对小鼠淋巴细胞的DNA损伤更强，有统计学意义，但有意思的是Hg与Pb，Hg与Cd联合染毒与单独染毒对DNA损伤没有统计学差异［19］。

目前对骨科植入物有毒或有可能致毒金属元素的含量没有一个明确的规定，更多参考的是药物或食品安全标准对金属的要求［20，21］。中国国家标准化管理化委员会制定的外科植入物用不锈钢（GB 4234—2003）标准规定：Cu的质量分数应≤0.5%、Mn的质量分数应≤2%，而对Cr的质量分数定在17%～19%，这些规定更多的是考虑提高冶炼工艺［22］。中华人民共和国药典2010年版一部规定：Pb，Cd，As，Hg，Cu的含量分别不超过5，0.3，2，0.2，20mg／kg［23］。同时中华人民共和国药典2010年版二部也规定Cr的含量不得超过2mg／kg。因此在Cr的含量规定来看，中国国家标准化管理化委员会制定的外科植入物用不锈钢（GB 4234—2003）标准规定和中华人民共和国药典2010年版相差较远，有可能前一个是考虑的植入物，后一个考虑的是口服药。参照中华人民共和国药典2010年版一部规定，A，B，C，D复合材料Cr的含量都是超标的，分别超标101，46，18，6倍，但按照中国国家标准化管理化委员会制定的外科植入物用不锈钢（GB 4234—2003）又是符合要求的，因此在Cr的含量规定方面今后是需要更多研究的。世界卫生组织和联合国粮农组织（WHO／FAO）将Al作为食品污染物加以控制，规定Al摄入量为每千克每周7mg／kg的标准。也有规定70kg体重的人每天 Al，Cu，Cr，Pb，Cd的摄入量不超过5，2.5，0.2，0.415，0.057mg［20］。参照中华人民共和国药典2010年版规定，除Cr外，C，D复合材料是符合规定的，B复合材料Hg含量超标，超过标准11倍，A复合材料Hg含量超标，超过标准13倍。但是植入物与药物、食物含有的金属相比较，还要考虑金属物质从C／C复合材料溶出率的因素，即某种金属物质在一定时间段从C／C复合材料溶出的数量［24］。

从以上分析看，A，B C／C复合材料表面成骨细胞生长差的原因与其含有的有毒金属物质超标是有关的，特别是Hg含量，但是也要考虑每一种物质虽然没有超标、但是几种物质联合的协同毒性作用［19］。A，B C／C复合材料有毒金属物质含量高与其制造工艺有关，因为在原始基体密度为0.5g／cm3到1.3g／cm3的C／C复合材料（A）制作中，密度增加了0.8g／cm3，但是2800～3200℃进行石墨化处理4h不能把有毒金属物质全部气化；1.3g／cm3C／C复合材料（A）到1.5g／cm3C／C复 合 材 料 （B），密 度 只 增 加 了 0.2g／cm3，2800～3200℃石墨化再处理4h累计高温处理8h（即原始1.3g／cm3C／C复合材料部分高温处理累计8h，新增的0.2g／cm3C／C复合材料高温处理处理4h）；1.7g／cm3（C）同样道理，高温累积处理12h（即原始1.3g／cm3C／C复合材料部分高温处理累计12h，第一次新增的0.2g／cm3C／C复合材料高温处理累计8h，第二次新增的0.2g／cm3C／C 复合材料处理 4h）；1.7g／cm3（D）高温处理累计16h。由于在C／C复合材料基体制造过程中、碳氢气体的纯度等原因造成C／C复合材料含有各种杂质。Al的熔点为660℃、沸点2467℃，Cr的熔点为1857℃、沸点2672℃，Cd的熔点为320℃、沸点765℃，Pb的熔点为327℃、沸点1740℃，Hg的沸点356℃，都低于 C／C复合材料4100℃的熔点，因此利用C／C复合材料耐高温的特点可以把其含有的金属物质溶解、甚至气化，达到祛除有毒金属元素物质的目的。随着高温热处理时间的延长（从12～16h），C／C复合材料上的杂质含量继续减少，但不能提高成骨细胞的生长数量，两者C／C复合材料表面成骨细胞形貌相似，由于高温热处理的成本较高，因此认为12h为最佳的高温热处理时间。

第8天时，A，B两者材料表面细胞数都较少，A材料表面细胞数（700个左右）大于B材料表面细胞数（300个左右），但B复合材料中元素含量均低于A，产生这种现象的原因有可能细胞受到材料毒性一段时间刺激后，细胞产生一定的增殖反应。但对于整个实验来说（C材料表面19500个细胞数），300与700个细胞数量造成的差异没有统计学意义。

本研究依据中华人民共和国国家标准对医疗器械生物学评价的要求，对C／C复合材料（1.7g／cm3）进行细胞毒性实验、急性全身毒性实验、溶血实验、热源实验、肌肉植入实验等生物学安全性评价研究，认为C／C复合材料的各项生物学性能指标符合国家标准要求，无细胞毒性和全身毒性、无热源性，具有良好的生物相容性，该研究成果已发表［25］。

3 结论

（1）随着高温（2800～3200℃）石墨化处理时间的延长，C／C复合材料毒性物质的种类或含量会去除或减少。

（2）成骨细胞在12，16h高温处理后的C／C复合材料表面生长良好，而在4，8h高温处理后的C／C复合材料表面生长差。

（3）提高C／C复合材料生物相容性的最佳石墨化高温处理时间为12h。

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