跳骨片中马兜铃酸A的限量测定

林武俊，陈小玉，刘可福

(1.福州屏山制药有限公司，福建 福州 350007；2.福建中正药业有限公司，福建福州 350004；3.福建省汀州医院 ，福建 长汀 366300)



跳骨片中马兜铃酸A的限量测定

林武俊1，陈小玉2，刘可福3

(1.福州屏山制药有限公司，福建 福州 350007；2.福建中正药业有限公司，福建福州 350004；3.福建省汀州医院 ，福建 长汀 366300)

目的：研究跳骨片中马兜铃酸A的限量测定方法。方法：色谱柱为Shimpack Vp-ods (4.6mm×15cm)C18柱,流动相为: 甲醇-1%冰醋酸(51∶49);流速:1.0mL/min，检测波长为260nm。结果：进样量在20.04～1 282.5ng范围内与峰面积呈良好线性关系(r=0.999 98);平均回收率为98.50%,RSD为0.74%(n=6)。经HPLC含量测定，其马兜铃酸A的含量极低(2～20μg·g-1)。对10批成品进行检测，其含量均小于20ppm，参照ICH对氯仿残留的限定，浓度限定<60ppm,PED<0.6mg/d,本产品马兜铃酸A含量低于该限度。结论：该法简便准确,结果可靠，可用于测定跳骨片中马兜铃酸A的限量。

马兜铃酸A； 跳骨片；高效液相色谱法；限量测定

跳骨片为我公司主要中药制剂，为骨伤科验方，临床沿用百余年，疗效确切，使用过程中未发现不良反应。本品处方中含有细辛，细辛为马兜铃科植物，细辛中含有微量马兜铃酸[1-4]，为保证用药安全，拟对投料所生产的跳骨片进行研究，建立马兜铃酸A的HPLC限量测定检查法。

1 仪器及试药

日本岛津LC-10AVP高效液相色谱仪，甲醇为色谱纯，其它试剂为分析纯，水为超纯水；马兜铃酸A对照品为中国食品药品生物制品检定研究院提供,批号：110746-200406；跳骨片为福州屏山制药有限公司生产。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Shimpack Vp-ODS(4.6mm×15cm)C18。流动相：甲醇-1%冰醋酸(51∶49)，流速1mL/min。检测波长为260nm。理论塔板数按马兜铃酸A峰计不低于2 000。其分离度大于1.5。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取马兜铃酸A对照品12.83mg，置25mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取1mL，置100mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得(每lmL中含马兜铃酸5.13μg)。与样品的马兜铃酸A浓度接近。

2.2.2 供试品溶液制备 取本品40片，除去糖衣，研细，取8g，精密称定，置150mL锥形瓶中，精密加入10%甲酸丙酮100mL，密塞，精密称重，超声处理40min，取出，精密称重，用10%甲酸丙酮补足损失的量，摇匀，滤过，弃去初滤液约5mL，精密吸取续滤液75mL，置水浴上蒸干，残渣加0.1mol/L氢氧化钠溶液25mL分次溶解，转入分液漏斗中，加氯仿萃取3次，每次15mL，弃去氯仿溶液，收集碱水液加5mol/L盐酸溶液调节pH=2，加氯仿萃取4次，每次15mL，合并氯仿溶液，水浴蒸干，残渣加甲醇分次溶解，转入5mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。进样前用0.45μm滤膜滤过。作为供试品溶液。

2.2.3 阴性对照品溶液制备 取缺细辛的跳骨片阴性对照品，研细，精密称取8g，按供试品溶液的制备方法同法制备，即得。

2.3 系统适应性试验

分别精密吸取供试品溶液、阴性溶液、对照品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定色谱峰,结果阴性样品对马兜铃酸A测定无干扰。

2.4 线性关系考察

取马兜铃酸A对照品溶液(0.513mg/mL)，用甲醇按梯度稀释成128.25、64.125、32.063、16.031、8.016、4.008、2.004μg/mL,分别进样10μL，按“2.1”项色谱条件测定峰面积；以对照品进样量为横坐标,以相应的峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为：Y=921.1X+254.9，r=0.999 98，表明进样量在20.04～1 282.5ng范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.5 精密度试验

取样品测定下对照品溶液10μL，重复进样6次，测定对照品溶液峰面积，求得峰面积平均值为42 542，峰面积值的RSD=0.56%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取供试品溶液(批号：131002)，在0、2、4、6、8h分别进样10μL，记录马兜铃酸A的峰面积，结果表明，供试品溶液在8h内较稳定，其峰面积平均值为41 359,RSD=0.62%。

2.7 重现性试验

取同批跳骨片样品(批号：131002)，按供试品溶液制备方法操作，依含量测定项下方法测定6次，计算含量，结果其马兜铃酸A的平均含量为4.285μg·g-1，RSD=0.73%(n=6)，表明该方法重现性良好。

2.8 加样回收率试验

精密吸取32.063μg/mL对照品溶液1mL，置于三角瓶中，挥干溶剂，加入跳骨片细粉8g(批号：131002)，精密称定，按照供试品溶液的制备方法操作。按含量测定项下方法测定，计算回收率，平均回收率为98.50%，RSD值=0.74%。结果见表1。

表1 加样回收率结果

2.9 限量测定

取10批跳骨片样品,除去糖衣，研细，取药粉8g，精密称定，再按上述供试品溶液的制备方法同法制备，分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液10μL，按上述色谱条件测定，按外标法计算含量，结果见表2。由含量测定可知，每1g跳骨片中含有马兜铃酸的限量仅为20ppm，参照ICH对氯仿残留的限定，浓度限定<60ppm，PDE<0.6mg/d，跳骨片的马兜铃酸的含量低于该限度。

表2 跳骨片中马兜铃酸A的限量测定结果 (n=4)

3 讨论

采用HPLC法测定跳骨片中马兜铃酸的限量，样品在8h内稳定，RSD=0.62%，平均回收率为98．50%，RSD=0.74%。实验结果表明，该方法准确、灵敏度高、重现性好，可作为跳骨片中马兜铃酸A限量测定方法。样品的纯化参考供试品制备方法，结果本法提取较为完全，系统误差小。对甲醇-1%冰醋酸的比例进行了对比性选择实验，结果其比例为51∶49时，样品分离度最好。马兜铃酸A是马兜铃属植物的主要有效成分，为了避免马兜铃酸A引起的毒性反应，使用时应严格掌握剂量和用药时间，避免超量或长期服用。同时，对已生产的成药中，需迅速补充和制定成药中马兜铃酸A限量控制标准，达到用药安全有效的目的。跳骨片中马兜铃酸A含量甚微，因此正常使用不致引起肝、肾损害。

[1] 吴艳蓉,贾凌云,高福坤,等.不同产地辽细辛中马兜铃酸的痕量检测[J].中药研究与信息,2005, 7(1):9-10.

[2] 姜旭,王智民,由丽双,等.RP-HPLC测定不同产地青木香和细辛中马兜铃酸A的含量[J].中国中药杂志,2004,29(5):408-410.

[3] 关文秋,李晓蒙,肖佳尚.可逆高效液相色谱法测定细辛药材及其制剂中马兜铃酸的含量[J].中国药物与临床,2005, 5(4):44-46.

[4] 谢昭明,李顺祥,廖汉成.HPLC法测定细辛药材中马兜铃酸A的含量[J].中南药学,2003,1(3):165-167.

(责任编辑：宋勇刚)

2014-01-17

林武俊(1966-)，男, 福建省福州屏山制药有限公司主管药师,研究方向为药物分析和新药研究开发。

R284.1

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1673-2197(2014)10-0037-02