淡水鱼加工下脚料自溶水解工艺的研究

吴朝朝，刘 华，赵 利 *，江 勇，袁美兰，陈丽丽

（1.南昌大学 生命科学与食品工程学院，江西 南昌 330029；2.江西科技师范大学 生命科学学院，江西 南昌 330013；3.国家淡水鱼加工技术研发分中心（南昌），江西 南昌 330013）

鱼露又称鱼酱油，其营养丰富，味道独特，是我国沿海一带及日本、东南亚各国人民传统的调味品[1-2]。过去绝大部分的鱼露是以海水鱼[3-4]为材料制造而成的，因此对鱼露营养成分和食用口味的研究范围有限。近年来，不少学者也开始专注于利用淡水鱼[5]如鲢鱼[6-7]、罗非鱼[7-8]等的下脚料[9-10]进行鱼露加工的研究。由于淡水鱼加工产生大量下脚料，且通常仅粗加工成饲料或者直接废弃掉，未得到充分的利用，因此利用淡水鱼的下脚料加工鱼露不仅体现了节约资源、充分利用的环保理念，也使得开发高质量、低成本的鱼露成为可能[9]，且对提高淡水鱼的利用价值具有重要意义[11]。淡水鱼的下脚料尤其是肝脏、鱼头中因含有丰富的内源性蛋白酶，可通过下脚料自身蛋白酶的水解作用将蛋白质水解为氨基酸和多肽，因此研究淡水鱼类下脚料的自溶水解[12]对利用其开发鱼露制品很有必要，并能够为后续的鱼露加工研究工作奠定理论基础和参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

淡水鱼下脚料：来源于江西鄱阳湖水产食品有限公司，平板冻结后运输到实验室，-18℃冷冻保存，使用前在10℃以下进行流水解冻。

甲醛、氢氧化钠、硫酸、盐酸、乙醚、硼酸均为分析纯：南康市华亿化工有限公司。

1.2 仪器与设备

JJ-2高速组织捣碎机：上海标本模型厂；TDL-5A离心机：上海菲恰尔分析仪器有限公司；DELTA-320精密pH计：美国梅特勒-托利多公司；HH-4数显恒温水浴锅、85-1磁力搅拌器：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；UT-12电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；SX2-4-10箱式电炉：上海嘉益电炉有限公司。

1.3 方法

1.3.1 淡水鱼下脚料成分分析

下脚料中水分的测定：GB5009.3—2010《食品中水分的测定》；蛋白质含量的测定：GB 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》；灰分的测定：GB 5009.4—2010《食品中灰分的测定》；脂肪含量的测定：GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的测定》。

1.3.2 淡水鱼下脚料自溶水解的工艺流程

淡水鱼下脚料→解冻→打浆→加水→调pH→恒温自溶水解→高温灭酶活→离心沉降→测量指标

1.3.3 淡水鱼下脚料处理方法

淡水鱼下脚料在10℃以下进行流水解冻后，用捣碎机打浆，称质量，按设定的水解条件（加水量、调节pH、水解温度、水解时间）在恒温水浴锅中进行水解试验，水解过程中每天早晚各搅拌一次，水解完成后，90℃、20min灭酶活，离心沉降，测定水解澄清液中氨基酸态氮（amino acid nitrogen，AA-N）含量。

1.3.4 自溶水解工艺条件单因素试验

温度对自溶水解的影响：精确称取每份100.0g打浆好了的鲜鱼下脚料6份，用氢氧化钠（或盐酸）调配溶液pH值为6.0，水/鱼下脚料比例为0.25∶1，用保鲜膜封好杯口，分别放在35℃、40℃、45℃、50℃、55℃的恒温水浴箱恒温保存48h，测定水解澄清液的AA-N含量，确定较适自溶水解的温度。

pH对自溶水解的影响：精确称取每份100.0g打浆好了的鲜鱼下脚料7份，按照水/鱼下脚料0.25∶1的比例添加蒸馏水，用氢氧化钠（或盐酸）调配溶液pH值分别为4、5、6、7、8、9、10，用保鲜膜封好杯口，放在40℃的恒温水浴箱恒温保存48h，测定水解澄清液的AA-N含量，确定较适自溶水解的pH值。

加水比对自溶水解的影响：精确称取每份100.0g打浆好了的鲜鱼下脚料5份，用氢氧化钠（或盐酸）调配溶液pH值为5.0，按水/鱼下脚料的比例分别为0∶1、0.25∶1、0.50∶1、0.75∶1、1.00∶1添加蒸馏水，用保鲜膜封好杯口，放在40℃的恒温水浴箱恒温保存48h，测定水解澄清液的AA-N含量，确定较适自溶水解的加水比。

时间对自溶水解的影响：精确称取每份100.0g打浆好了的淡水鱼下脚料3份，按照水/鱼下脚料0.25∶1的比例添加蒸馏水，氢氧化钠（或盐酸）调整pH值为5.0，用保鲜膜封好杯口，放在40℃的恒温水浴箱恒温保存，分别于12h、24h、36h、48h、60h、72h，测定水解澄清液的AA-N含量，确定较适自溶水解的时间。

1.3.5 响应面试验设计

应用Box-Behnken试验设计原理，在单因素试验确定的最佳试验因素水平的基础上进行响应面试验，选择时间（A）、pH（B）、温度（C）为考察对象，以氨基酸态氮含量（Y）为考察指标，采用Design Expert v 7.1.6软件进行响应面试验，试验的因素水平如表1所示。

表1 淡水鱼加工下脚料自溶水解工艺优化响应面试验因素与水平Table 1 Factors and coded levels of response surface analysis for freshwater fish processing leftovers autolysis technology optimization

1.3.6 游离氨基酸态氮含量的测定[13]

氨基酸态氮含量测定采用甲醛滴定法，计算公式如下：

式中：AA-N为样品中氨基酸态氮的含量（以氮计），g/100mL；V2为滴定样品稀释液消耗0.05mol/L氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；V1为空白试验消耗0.05mol/L氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；C为氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，mol/L；0.014为氮的毫摩尔质量，g/mmol；m为测定试样溶液相当于试样的质量，g。

2 结果与分析

2.1 淡水鱼加工下脚料基础成分

淡水鱼下脚料基本成分如表2所示。

表2 淡水鱼加工下脚料的基本成分Table 2 Elementary component of freshwater fish processing leftovers

由表2可知，淡水鱼下脚料蛋白质含量8.65%（以干质量计为36.90%），含量较高，是较好的蛋白质资源，可以作为蛋白质资源进一步加工利用。

2.2 淡水鱼下脚料自溶水解单因素试验

2.2.1 温度对淡水鱼加工下脚料自溶水解的影响

温度对淡水鱼加工下脚料自溶水解的影响结果见图1。

图1 不同温度下氨基酸态氮含量的变化Fig.1 Change of nitrogen content with different temperature

由图1可知，在水/鱼下脚料0.25∶1、初始pH值为6.0，35℃、40℃、45℃、50℃、55℃条件下水解48h，氨基酸态氮含量随温度的不同发生明显变化。方差分析结果显示，不同温度之间（35～55℃）对氨基酸态氮含量影响均显著（P＜0.05）。从35～40℃的过程中，自溶水解氨基酸态氮含量逐渐增加，40℃达（0.784±0.004）g/100mL，从40～55℃的过程中氨基酸态氮含量逐渐降低，且50℃以后氨基酸态氮含量降低的速度很快，原因是内源性蛋白酶因温度增高活性降低，温度＜35℃，腐败微生物的快速繁殖会导致鱼露有腐败的危险[14]，通过感官及微生物检测，40℃自溶水解48h没有发生腐败。从图1可以看出，40℃是内源性蛋白酶较适宜的水解温度。

2.2.2 初始pH值对淡水鱼加工下脚料自溶水解的影响

初始pH值对淡水鱼加工下脚料自溶水解的影响结果见图2。

图2 不同初始pH值下氨基酸态氮含量的变化Fig.2 Change of amino nitrogen content with different initial pH

由图2可知，在温度为40℃、水/鱼下脚料0.25∶1的条件下自溶水解48h，水解液的氨基酸态氮含量随初始pH的不同而发生明显的变化。方差分析显示，pH在4.0～7.0对氨基酸态氮含量影响均显著（P＜0.05），且pH值为5.0的显著性最大，pH4.0和pH8.0对氨基酸态氮含量的影响无显著差异（P＞0.05）。在初始pH值为4.0～5.0，水解离心澄清液的氨基酸态氮的含量逐渐增加，当pH值为5.0时，氨基酸态氮含量达（1.038±0.004 6）g/100mL；在初始pH值为5.0～10.0，水解液的氨基酸态氮含量逐渐降低，可能是因为内源性蛋白酶虽是混合酶，每种酶的含量不一样，在一定的条件下也会表现出最适宜的酶解pH[15]，过高或过低的pH都会抑制其催化活性。由图2可知，初始pH值为5.0得到的氨基酸态氮含量最高。

2.2.3 加水比对淡水鱼下脚料自溶水解的影响

加水比对淡水鱼下脚料自溶水解的影响结果见图3。

由图3可知，在初始pH值为5.0、温度为40℃下自溶水解48h，水解液的氨基酸态氮随水/鱼下脚料的不同比例而发生明显变化。方差分析显示，不同加水比对氨态氮含量影响显著（P＜0.05）。水/鱼下脚料比例为0∶1时离心澄清液中的氨基态氮含量最高，达（0.987±0.0046）g/100mL，随着加水量的增加氨基酸态氮的含量逐渐降低，当水/鱼下脚料为1∶1时，氨基酸态氮的含量为仅为（0.680±0.0017）g/100mL。原因是加水比小，相应的内源性蛋白酶浓度增加，在相同的条件下产生的氨基酸增加。但是结合实际，自溶水解过程中不加水，得出的鱼露浓度过大，试验操作不易进行且不经济，因此，选取水/鱼下脚料为0.25∶1较为适宜。

图3 不同加水比下氨基酸态氮含量的变化Fig.3 Change of amino nitrogen content with different water addition ratio

2.2.4 水解时间对淡水鱼加工下脚料自溶水解的影响

水解时间对淡水鱼加工下脚料自溶水解的影响结果见图4。

图4 氨基酸态氮含量随水解时间的变化Fig.4 Change of amino nitrogen content with autolysis time

由图4可知，在温度为40℃、初始pH5.0、水/鱼下脚料为0.25∶1的条件下自溶水解24h、36h、48h、60h，水解液中氨基酸含量随水解时间的延长而逐渐增加。方差分析显示，水解时间对氨基酸态氮含量影响均显著（P＜0.05），且36h显著性最大。在12～36h时间段氨基酸态氮含量增加较快，氨基酸态氮含量从（0.335±0.007）g/100mL上升至（0.789±0.012）g/100mL，48～72h氨基酸态氮含量增加缓慢，到48h达（0.847±0.023）g/100mL，随后曲线逐渐趋于平缓。主要原因是随着水解时间的延长，内源性蛋白酶的催化活性逐渐降低[4]，从提取效率及动力能源等因素考虑，选择48h为自溶水解的最适水解时间。

2.3 淡水鱼下脚料自溶水解的响应面试验

根据单因素试验结果，选择对淡水鱼下脚料自溶水解影响较大的3个因素：时间（A）、初始pH值（B）、温度（C）为考察对象，以氨基酸态氮含量（Y）为考察指标，采用Design Expert v7.1.6软件进行响应面试验[16]。试验的设计及结果见表3，回归方程方差分析见结果见表4。

表3 淡水鱼下脚料自溶水解工艺响应面试验设计及结果Table 3 Design and results of response surface analysis for freshwater fish processing leftovers autolysis technology optimization

表4 响应面二次模型方差分析Table 4 Variance analysis of quadratic regression model

由表4可知，时间（A）、pH（B）、温度（C）3个各因素对水解液中氨基酸态氮的含量影响均极显著，影响由小到大顺序是A＞B＞C。

图5 各因素两两交互作用对氨基酸态氮含量影响的响应面及等高线Fig.5 Response surface plot and contour line of interaction among each two factors on amino acid nitrogen content

各因素两两交互作用的响应面分析结果见图5。由图5可知，初始pH值和时间对水解液中氨基酸态氮含量的影响存在交互作用；水解时间和水解温度对水解液中氨基酸态氮含量的影响存在交互作用；初始pH值和水解温度对水解液中氨基酸态氮含量的影响存在交互作用。通过统计分析软件Design-Expert.V8.0.6 进行数据分析，建立二次响应面回归模型如下：

由表4可知，方程因变量与自变量之间的线性关系明显，该模型回归显著（P＜0.000 1）说明该模型与试验拟合良好，自变量与响应值之间线性关系显著，可用于该反应的理论推测。

2.4 自溶水解模型的验证试验

采用响应面分析，得到淡水鱼加工下脚料自溶水解最佳工艺条件为水解时间48h，水解温度45℃，水解初始pH值5.0，预测自溶水解氨基酸态氮含量为1.062 2g/100mL。由于得到的最佳组合条件不在响应面试验组合内，所以需在最佳组合条件下进行验证试验。在此条件下进行自溶水解试验，氨基酸态氮含量为（1.046 3±0.03）g/100mL，与预测值相差1.50%，说明响应面的试验值与回归方程预测值基本吻合，建立的模型可以对实际工艺进行预测。

3 结论

以氨基酸态氮含量为考察指标，通过单因素试验确定淡水鱼加工下脚料自溶水解的加水比、pH、温度、时间的最适范围。采用Design Expert v7.1.6软件，通过Box-Behnken试验得到水解度与时间（A）、pH（B）、温度（C）关系的回归模型，回归方程为：Y=0.72+0.18A－0.043B+0.030C－0.008 5AB－0.013AC－0.025BC－0.057A2+0.078B2+0.003 6C2。淡水鱼加工下脚料自溶水解最适宜工艺条件为水解时间48h，水解温度45℃，水解初始pH值为5.0。水解时间、温度、初始pH值3因素对响应值的影响均显著。回归模型的试验验证表明淡水鱼加工下脚料自溶水解液中氨基酸态氮含量达到了（1.046 3±0.03）g/100mL，与模型的预测值1.062 2g/100mL基本吻合，证明模型方程能很好的预测淡水鱼加工下脚料内源性蛋白酶自溶水解程度与温度、时间、初始pH值之间的关系。利用淡水鱼下脚料内源性蛋白酶水解其蛋白质，研究了响应面优化自溶水解的工艺，为后续利用淡水鱼下脚料加工鱼露的研究提供了一定的参考依据。

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