蛇龙珠与卡曼娜葡萄酒主要呈香物质鉴定

蔡 建，朱保庆，兰义宾，段长青*

（1.中国农业大学 食品科学与营养工程学院 葡萄与葡萄酒研究中心，北京 100083；2.北京林业大学 生物科学与技术学院，北京 100083）

蛇龙珠（Cabernet Gernischt）是我国主要酿酒葡萄品种之一，在山东烟台及甘肃河西走廊等地区有广泛种植，但其来源和品种的亲缘关系问题在业内曾一直存在较大争议。尹克林等[1]曾通过对葡萄品种叶形结构的多元判别分析提出蛇龙珠与赤霞珠并非同一品种，可能是源于法国的品丽珠（Cabernet Franc）。随后罗国光[2]也推测蛇龙珠就是品丽珠，或可能是经过多年人工选择下形成的品丽珠新品系。为了进一步揭示蛇龙珠的品种来源和亲缘关系，姚玉新等[3-4]对蛇龙珠及其他酿酒葡萄品种进行随机扩增多态性DNA标记（random amplified polymorphic DNA，RAPD）技术分析后均发现蛇龙珠、赤霞珠、品丽珠和美乐是4个独立的品种，蛇龙珠都与品丽珠遗传距离最近而与赤霞珠、美乐较远。李玉霞等[5]则通过RAPD技术分析后证实，蛇龙珠与法国波尔多古老酿酒品种卡曼娜（Carménère）的遗传距比品丽珠更近，并推断蛇龙珠与卡曼娜可能就是同一品种（系），而非之前认为的品丽珠。李红娟等[6]最近的研究也证实蛇龙珠与品丽珠并非同一品种。钟晓敏等[7]研究了不同品系蛇龙珠与其他品种的亲缘关系发现，蛇龙珠与卡曼娜的相似度达98.29%～100%，从而进一步证实了蛇龙珠与卡曼娜是同一品种。

蛇龙珠葡萄酒香气具有典型的草本植物香气，但与赤霞珠常有的青椒或甜椒气味有所区别。目前国内已有一些利用气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析蛇龙珠葡萄酒香气物质组成的报道，但由于检测方法定性定量准确性的限制，对该品种葡萄酒特征香气物质组分的研究结果仍不明确。李华等[8]在蛇龙珠葡萄酒中检测出苯乙醇等29种挥发性风味物质，但并未对其这些物质进行精确定量。张明霞等[9]对蛇龙珠、赤霞珠和品丽珠3个单品种葡萄酒的香气组成进行了定性定量分析，并结合香气阈值对这些物质对香气的贡献进行评估。该研究在蛇龙珠葡萄酒中共检测出50种挥发性物质，其中主要呈香物质种类与赤霞珠和品丽珠类似，主要为辛酸乙酯、己酸乙酯和乙酸异戊酯3种物质。姜文广等[10]对蛇龙珠和美乐葡萄酒香气组成进行了研究，并在其中分别鉴定出75和82种挥发性物质，但仅对其进行了相对定量。李霞等[11]在蛇龙珠葡萄酒中共检测出57种挥发性物质，并对其进行了定量，同时还发现浸渍酶可增加蛇龙珠葡萄酒中部分萜烯类物质的含量。尹建邦[12]首次利用气相色谱-嗅觉测量法（GC-O）技术和香气活性值（odor activity value，OAV）对蛇龙珠葡萄酒特征香气组分进行了鉴定，发现辛酸乙酯、己酸乙酯、异丁酸乙酯、异戊酸乙酯、异戊酸和β-大马士酮是该品种的主要呈香物质。

卡曼娜虽然为法国波尔多地区的本土品种，但在19世纪末根瘤蚜侵害欧洲葡萄园后，在波尔多地区的种植面积就很少了。目前该品种主要栽培地区在智利，并有大量以该品种酿造的单品种优质葡萄酒。同蛇龙珠类似，卡曼娜葡萄酒的香气中也有一种淡淡的植物气息，但由于在智利其成熟度较好，这种植物气息相对于我国的蛇龙珠而言相对较弱，更多的是呈现一些深色水果的香气。因此，本研究以我国河西走廊地区的蛇龙珠葡萄酒和智利的卡曼娜葡萄酒为研究对象，试图通过其香气物质分析找出这一共同源自法国的葡萄品种在两种气候模式下所酿造出葡萄酒的特征香气物质的异同。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蛇龙珠干红为2009年份酿造，原料产自甘肃高台，苹果酸-乳酸发酵（malolactic fermentation，MLF）结束后入法国新橡木桶（中度烘烤）陈酿12个月，瓶储1年后进行检测。卡曼娜干红为2010年酿造，产自智利莫莱山谷（VALLE DEL MAULE）开瓶后立即进行检测。每个样品重复检测3次后取平均值。

香气物质标样及纯度、生产商与参考文献[13]相同。

1.2 仪器与设备

50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取纤维头、固相微萃取装置：美国Supelco公司；6890-5975型气质联机、HP-Innowax色谱柱（60m×0.25mm×0.25μm）：美国Agilent公司；Sniffer 9000型嗅闻仪：瑞士Brechbuhler公司。

1.3 实验方法

1.3.1 顶空-固相微萃取条件

称取1.0g NaCl放入15mL样品瓶，依次加入磁力搅拌子（长0.5cm）、5mL葡萄酒样品、10μL内标（4-甲基-2-戊醇水溶液，2.004mg/L），迅速用带有聚四氟乙烯隔垫的盖子密封，置于磁力加热搅拌台上加热搅拌30min，然后将活化后的顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）萃取头插入样品瓶顶空部分，40℃继续加热搅拌30min。取下萃取头，立即在GC进样口（250℃）解析8min。

1.3.2 GC-MS分析条件

气相色谱条件：采用HP-Innowax色谱柱，载气为高纯氦气，流速1mL/min；进样口温度为250℃，采用不分流进样模式，解析时间8min；升温程序为50℃保持1min，然后以3℃/min升温至220℃，保持5min。

质谱条件：电子电离（electron ionization，EI）源，离子源温度为230℃，电离能为70eV，四级杆温度为150℃，质谱接口温度为280℃，质量扫描范围为29～350m/z。

1.3.3 化合物定性定量

化合物的定性采用自动质谱解卷积和鉴定系统（automated mass spectral deconvolution&identification system，AMDIS）软件结合已建立的葡萄酒香气物质检索谱库对GC-MS全扫描数据文件进行解卷积分析，AMDIS参数设定与参考文献[14]相同。自动质谱图解卷积和鉴定系统（AMDIS）是美国标准化委员会推出的一款辅助GC-MS数据定性分析的软件，利用该软件可有效的克服GC-MS定性分析中基质效应和共洗脱效应的干扰，增加解谱的准确性和可靠性[14]。在定性过程中，根据各物质的保留时间计算相应的保留指数（retention index，RI）。将该组分的RI同标样RI、质谱图及美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）Chemical WebBook

中收录的wax类型柱条件下测得的RI比较，差值绝对值小于50的组分可定性为该化合物。化合物定量方法及标样信息与参考文献[13]相同，对于已有标样的物质，利用其对应的标准曲线定量。对没有标样的物质利用化学结构、官能团相似、碳原子数相近的标样香气物质的标准曲线定量。

1.3.4 香气活性值（OAV）计算

香气活性值（OVA）（简称香气值）是评价葡萄酒挥发性组分对实际香气贡献大小所普遍采用的一个指标，目前国内外已有许多研究者应用该指标对葡萄酒挥发性组分的香气贡献进行评价，或使用该指标来寻找某种葡萄酒香气的主体呈香物质或特征化合物[15-17]。每种挥发性组分的OAV是由该物质的含量除以其嗅觉阈值得到的，本研究中的嗅觉阈值及气味描述均引自参考文献[13]。

2 结果与讨论

2.1 香气物质组成

通过AMDIS技术对GCMS总离子流图谱进行解析后在蛇龙珠和卡曼娜葡萄酒中共鉴定出116种挥发性物质，结果见表1。

表1 蛇龙珠与卡曼娜葡萄酒中香气物质组成Table 1 Aroma compositions in Carménère red wines from China and Chile

续表

由表1可知，蛇龙珠中鉴定出113种物质，卡曼娜中111种。乙酸己酯、2，4-己二烯酸乙酯、7-辛烯酸乙酯、β-香叶烯和橙花醚仅在蛇龙珠中检测而卡曼娜中未检出，苯甲酸甲酯、糠酸甲酯和4-甲基愈创木酚仅在卡曼娜中检测而蛇龙珠中未检出。所有检出的物质共包括14个类别，分别为C6醇、高级醇、乙酸酯、脂肪酸乙酯、脂肪酸高级醇酯、有机酸、醛、酮、萜烯、降异戊二烯、呋喃、内酯、挥发性酚和甲氧基吡嗪。其中包含物质种类最多的为高级醇和脂肪酸乙酯，分别包括27种和25种物质。总含量最大的也是高级醇和脂肪酸乙酯两类物质，在蛇龙珠中高级醇和脂肪酸乙酯的含量为挥发性物质总量的85.4%和13.6%，而在卡曼娜中这两类物质的比例分别为94.7%和4.3%，在2种葡萄酒中这两类物质的总量均达到了挥发性物质总量的99%。

蛇龙珠葡萄酒比卡曼娜含有更多的C6醇、脂肪酸乙酯、脂肪酸高级醇酯、有机酸、醛、降异戊二烯，而卡曼娜中的高级醇、乙酸酯、酮和萜烯的含量比蛇龙珠更高。此外，来源于橡木桶的呋喃和挥发性酚这两类物质的总量在两种葡萄酒中差异不大，同样来源于橡木的两种橡木内酯类物质则在蛇龙珠中含量较高，表明两种葡萄酒在陈酿过程中同橡木的接触时间或方式是有差异的。

2.1.1 C6醇和高级醇

C6醇类物质通常都具有植物或青草的气味，常常会给葡萄酒的香气带来负面的影响[15]。在蛇龙珠和卡曼娜葡萄酒中共检测出4种C6醇类物质，其中含量最大的为己醇。在蛇龙珠葡萄酒中，这4种C6醇的含量均比卡曼娜要高。

高级醇也常被称为杂醇油，这些物质一般具有较为强烈的刺激气味。这类物质是酵母酒精发酵的副产物，随着其含量的不同会对酒的香气产生或好或坏的影响。当其总量（不包括具有果香的2，3-丁二醇和具有花香的2-苯乙醇）较低时（＜300mg/L），可以增加葡萄酒香气的复杂性，但在高浓度时（＞400mg/L）会使酒的香气变得粗糙[18]。在蛇龙珠中，除2，3-丁二醇和2-苯乙醇以外的高级醇含量为412.33mg/L，而在卡曼娜中其含量为704.54mg/L，高级醇含量上的差异表明蛇龙珠的香气品质可能更为细腻。

2.1.2 酯类物质

在葡萄酒中，酯类物质是仅次于高级醇的第二大类挥发性物质，也是酵母酒精发酵过程中产生的次生代谢物，这类物质物质对葡萄酒的果香有着重要的贡献作用[19]。乙酸酯是由酵母氨基酸或糖代谢产生的高级醇和乙酰辅酶A反应形成，而脂肪酸乙酯则是由酵母脂肪酸代谢过程中产生的脂酰辅酶A醇解产生的[18]。同高级醇的差异趋势一致，蛇龙珠葡萄酒中高级醇乙酸酯的含量仅为卡曼娜中的29%，其中具有香蕉味的乙酸异戊酯含量差异最大，这一物质在蛇龙珠中的含量不足卡曼娜中的1/3。而脂肪酸乙酯含量的差异则完全相反，这类物质中的大多数在蛇龙珠中的含量都高于卡曼娜，其中最明显的几种物质包括乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、9-癸烯酸乙酯和水杨酸乙酯。

此外，乙酸己酯、2，4-己二烯酸乙酯、7-辛烯酸乙酯均在蛇龙珠中检测到了，而卡曼娜中没有检出。

2.1.3 脂肪酸

葡萄酒中的挥发性脂肪酸主要是由酵母和乳酸菌在脂肪酸代谢过程中产生的，这些物质一般都会呈现出脂肪、酸腐以及奶酪的气味。当其含量低于阈值时，这些物质可以增加葡萄酒香气的复杂性，但如果高于阈值则会给酒的香气带来负面影响[18]。蛇龙珠和卡曼娜葡萄酒中均检测出了7种脂肪酸，其总量和各自组成比例在两种葡萄酒中差异较小。丙酸和异丁酸的含量最大，其次是己酸，这3种酸的含量占脂肪酸总量的70%～80%。2种葡萄酒中差异最大的是丁酸，它在蛇龙珠中的含量是卡曼娜中的近两倍。

2.1.4 醛、酮

2种葡萄酒中共检测到10种羰基化合物（6种醛和4种酮），其中主要由苹乳发酵过程产生的乙偶姻是最主要的羰基化合物，其次是双乙酰。值得注意的是，蛇龙珠中的苯甲醛和苯乙酮的含量远远高于卡曼娜，这两种物质在蛇龙珠中的含量分别是在卡曼娜中含量的7.3倍和5.6倍。

2.1.5 萜烯和降异戊二烯

虽然为非芳香品种，但通过解卷积技术仍然在蛇龙珠和卡曼娜葡萄酒中检测出了12种萜烯类物质，其中蛇龙珠中检出11种，卡曼娜中检出10种。β-香叶烯和橙花醚仅在蛇龙珠中检出，而卡曼娜中没有检出。从萜烯类物质的总量来看，卡曼娜略高于蛇龙珠，除橙花醇和反式-呋喃型氧化里那醇外，其他萜烯都在蛇龙珠中含量较高。

降异戊二烯类物质对葡萄酒的香气有着重要的影响作用，因为这类物质的感官阈值普遍较低。2个样品中均检测到6种降异戊二烯类物质，但这些物质在两个样品中的含量差异较大。蛇龙珠中降异戊二烯的总量是卡曼娜的1.77倍，除超出检测限未能定量的β-紫罗兰酮外，其他5种物质在蛇龙珠中的含量均高于卡曼娜。

葡萄酒中的萜烯类物质和降异戊二烯类物质主要源于葡萄果实，由其前体物质在发酵和陈酿过程中逐渐释放出来的，这些物质的组成和含量更多地反映了葡萄原料自身的特征，而受到工艺因素的影响相对较小[20]。蛇龙珠和卡曼娜这两个由不同产地的同一葡萄品种酿造的葡萄酒在萜烯和降异戊二烯组成和含量上的差异，正反映了该品种在我国河西走廊和智利莫莱山谷这两种生态条件下的不同表现。

2.1.6 呋喃、内酯和挥发性酚

葡萄酒中的呋喃、内酯和挥发性酚这三类物质主要是在橡木桶陈酿过程中（或与其他橡木辅料接触）由橡木进入到葡萄酒中的。这些物质的组成差异主要反映了2种葡萄酒陈酿工艺的区别，尤其是陈酿用橡木桶的产地、烘烤程度和陈酿时间。从检测出的这些物质含量可以看出，蛇龙珠和卡曼娜葡萄酒中仅橡木内酯含量存在着较大的差异，其中蛇龙珠中橡木内酯含量高于卡曼娜，这说明蛇龙珠在橡木桶中的陈酿时间可能更长[21]。此外，2种葡萄酒中顺式和反式橡木比例也存在差异，说明陈酿用木桶的橡木品种或产地也是不同的[22]。

2.2 主要呈香物质鉴定

为了从众多挥发性物质中找出对香气贡献较大的物质，本研究对2种葡萄酒中挥发性组分的香气活性值（OAV）进行了计算，OAV＞1表明该物质含量超过了其阈值，对葡萄酒的香气有所贡献，OAV值越大表明其对香气的影响越大。蛇龙珠和卡曼娜葡萄酒中主要呈香物质的OAV值及其阈值、气味描述参考文献[13]，结果见表2。

表2 蛇龙珠与卡曼娜葡萄酒中的主要呈香物质香气值、阈值及气味描述Table 2 OAV,threshold value and odor description of Carménère red wines from China and Chile

由表2可知，蛇龙珠和卡曼娜葡萄酒中主要的呈香物质（OAV＞0.1）共有42种，其中蛇龙珠41种、卡曼娜38种。β-大马士酮、左旋-2，3-丁二醇、苯乙醛和己酸乙酯4种物质OAV在2种葡萄酒中均位于前四位（OAV均＞5.0），其OAV之和分别为OAV总和的57%（卡曼娜）和64%（蛇龙珠）。此外，在卡曼娜葡萄酒中，异丁醇的OAV也达到了6.41，仅次于上述4种物质。橡木内酯、乳酸乙酯和9-癸烯酸乙酯的含量在蛇龙珠中超过了其阈值，但在卡曼娜中均低于其阈值。具有典型香蕉香气的乙酸异戊酯对卡曼娜香气有较大贡献（OAV=3.33），但在蛇龙珠中其含量低于其阈值。

尹建邦[12]曾利用OAV值对蛇龙珠葡萄酒特征香气组分进行了鉴定，发现辛酸乙酯、己酸乙酯、异丁酸乙酯、异戊酸乙酯、异戊酸和β-大马士酮是蛇龙珠葡萄酒的主要呈香物质，这与本文的研究结果有所差异，除β-大马士酮和己酸乙酯外，辛酸乙酯、异丁酸乙酯、异戊酸乙酯和异戊酸在本文检测的蛇龙珠和卡曼娜葡萄酒中其含量均低于阈值。产生这种差异的原因可能有三个方面：首先是某些物质所参考的阈值不同，二是所测样品之间的差异，最后还有可能就是定量方法上的差异。

为了根据葡萄酒香气物质的组成对其香气轮廓进行模拟，参照其他相关研究[13，17]可以将各香气物质按其气味特征进行分组，将每一气味特征类似的物质归为一组，并计算该组的OAV总和，即可对样品的香气轮廓进行模拟。根据以检测出香气物质的气味特征将其分为11个组，分别为：1=水果香，2=植物味，3=干果香，4=焦糖味，5=霉土味，6=化学味，7=脂肪味/奶油味，8=花香，9=烘烤味，10=橡木味，11=香料味。具体分组方式见表2，部分物质由于对不同类别香气均有贡献，因此可能同时列入某几个组中。

图1 蛇龙珠与卡曼娜葡萄酒的香气轮廓图Fig.1 Aroma profile of Carménère red wines from China and Chile

图1为经上述方法获得的蛇龙珠与卡曼娜葡萄酒的香气轮廓图，其中干果香、霉土味和烘烤味由于OAV总和＜1，因此未列入图中。由图1可知，水果香、焦糖味、花香和脂肪味（奶油味）为两种葡萄酒的主要特征香气，其次为化学味和植物味。2种葡萄酒的总体香气轮廓较为相似，但也有所区别。蛇龙珠葡萄酒比卡曼娜具有更强的花香、焦糖味和橡木味，而化学味和植物味则略弱与后者。香气轮廓模拟的结果同2种葡萄酒感官品尝的结果基本相符，但植物味在两种酒的感官品尝中蛇龙珠高于卡曼娜，而模拟计算的结果却恰恰相反。造成这种差异的原因可能是某种（或某些）具有植物味的物质未能鉴定出或未能准确定量，这尚需要进一步研究才能确定这些物质。

3 结论

本文利用解卷积（AMDIS）技术并结合标样定性和保留指数定性在蛇龙珠和卡曼娜葡萄酒中鉴定出116种挥发性风味物质，并根据定量结果和各物质的感官阈值对每种物质的OAV值进行计算，寻找出两种葡萄酒中的主要呈香物质并根据OAV值对这两种葡萄酒的香气轮廓进行了模拟计算。本文研究发现我国河西走廊的蛇龙珠葡萄酒和智利莫莱山谷的卡曼娜葡萄酒总体香气轮廓较为相似，蛇龙珠的花香、焦糖味和橡木味相对较强。β-大马士酮、左旋-2，3-丁二醇、苯乙醛和己酸乙酯4种物质OAV均大于5.0，是2种葡萄酒共同的主要呈香物质。就香气物质组成而言，蛇龙珠中的C6醇类、脂肪酸乙酯、脂肪酸、醛、萜烯、降异戊二烯、和内酯类物质含量较高，而卡曼娜中的高级醇、乙酸酯和酮类物质含量较高。

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