c-fos、TRPV1导致慢性前列腺炎大鼠神经痛的实验研究*

刘迎嘉张 晨宋国宏

1. 新疆医科大学第五附属医院病理科（乌鲁木齐 830011）; 2. 新疆医科大学第五附属医院中医科

c-fos、TRPV1导致慢性前列腺炎大鼠神经痛的实验研究*

刘迎嘉1张 晨1宋国宏2**

1. 新疆医科大学第五附属医院病理科（乌鲁木齐 830011）; 2. 新疆医科大学第五附属医院中医科

目的探讨慢性非细菌性前列腺炎（chronic nonbacterial prostatitis，CNP）疼痛的可能机制。方法自身免疫法建立CNP大鼠模型；Von Frey丝检测机械刺激缩足阈（paw withdrawal threshold，PWT）；进行前列腺病理学检查和免疫组化检测前列腺与脊髓L5-S2节段c-fos、TRPV1的表达变化和相关性。结果造模后大鼠PWT下降，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。前列腺呈现炎症反应，在病变范围、淋巴细胞浸润方面都较对照组显著，差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组相比，模型组前列腺与脊髓背角L5-S2 中c-fos、TRPV1阳性表达均上调，差异有统计学意义（P＜0.05）。前列腺中与脊髓中的c-fos表达无相关关系（r=0.027，P=0.454）；并且两者的TRPV1表达也无相关关系（r=0.000，P=0.5）。结论 c-fos、TRPV1可能通过脊髓L5-S2节段的表达上调参与了CNP大鼠疼痛的形成和维持。

TRPV1; c-fos; 神经痛; 前列腺炎

慢性非细菌性前列腺炎（chronic nonbacterial prostatitis，CNP）主要表现为长期反复的骨盆区疼痛或不适，症状迁延难愈，反复发作，严重影响着患者的生活和精神心理状态，导致生活质量下降。所以进一步了解其发病机制对临床诊治尤为重要。研究显示CNP疼痛很可能与支配前列腺的神经传导通路和调控机制的异常有关，并且这种异常与L5-S2脊髓节段的继发性病变有关[1]。

本实验通过复制CNP大鼠模型，S-P免疫组化法观察比较前列腺及脊髓L 5-S 2背角中c-fos、TRPV1的表达变化和相关性，以期探讨CNP疼痛发生的可能机制，为临床诊治提供理论依据。

材料与方法

一、材料和动物

清洁级雄性Wistar大鼠30只，体质量160～180g，（新疆维吾尔自治区疾病控制中心）；TRPV1山羊抗鼠单克隆浓缩型抗体，（ABCAM，UK）；c-fos山羊抗鼠单克隆浓缩型抗体，（ABCAM，UK）；S-P试剂盒，（武汉博士徳生物工程有限公司）。蛋白定量测试盒（双缩脲法），（南京建成生物工程研究所）；TritonX-100，（北京 Solarbio 科技有限公司）；弗氏完全佐剂（FCA），（Sigma，USA）；百白破疫苗，（成都生物制品研究所）。

二、 造模与分组

参照前期实验[2]利用免疫法建立CNP模型。

取10只雄性Wistar大鼠，取出前列腺组织，加含0.5% TritonX-100等量的生理盐水制成匀浆离心取上清液。加生理盐水至浓度为60 mg/mL，以弗氏完全佐剂等比混匀。 Wistar大鼠20只随机分为模型组和对照组，每组10只。于腹股沟、颈背部、双后足4点皮内注射前列腺蛋白抗原液共1.0 mL，同时腹腔注射百白破疫苗0.5 mL。对照组在相同的时间和部位注射相同体积的生理盐水。

三、PWT检测

参照Chaplan等[3]的方法测定机械痛阈。将大鼠置于半透明有机玻璃笼中，用一系列标准化的细纤维（Von Frey纤维）刺激后肢足底中部，以纤毛稍弯曲作为完全受力的标准，使纤维弯成S形（代表机械刺激1～50g），持续6～8s，观察缩足反应。按照克数顺序（2、4、6、8、10、15、26g）依次使用Von Frey丝，每次刺激持续2s，间隔15 s，连续5次。能够引起3/5次抬腿的最低Von Frey丝克数被定义为PWT。模型组与对照组大鼠于造模后6周进行PWT测量，各组在同一时间分别进行检测。

四、前列腺组织病理变化

组织脱水石蜡包埋，4μm 连续切片，HE染色，光镜下观察前列腺炎症反应。判定标准[4]如下：

1. 病变范围为5级：0级基本正常；1级小部分病变；2级部分病变；3级大部分病变；4级全部病变。

2. 淋巴细胞浸润程度为3级：0级偶见或未见淋巴细胞浸润；1级偶见灶状分布的淋巴细胞或散在淋巴细胞浸润；2级灶状淋巴细胞浸润或淋巴细胞浸润呈片状分布。

3. 间质增生程度为4级：0级间质未见纤维增生；1级散在的纤维母细胞；2级纤维母细胞呈束状分布；3级纤维组织胶原变性或玻璃样变性。

五、前列腺及脊髓免疫组化检查

按S-P 试剂盒操作进行免疫组化染色。综合染色强度及阳性细胞数量进行半定量积分法判断结果。阳性细胞率积分：阳性细胞≤5%为0分，6%～30%为1分，31%～60%为2分，61%～90%为3分，＞90%为4分。染色强度积分：无特异性染色为0分，黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。将两项积分相乘，0分为阴性（-），1-4分为弱阳性（+），5～8分为中度阳性（++），9～12分为强阳性（+++）。

六、统计学分析

结 果

一、一般情况观察

造模6周后模型组大鼠体质量轻微减轻，活动减少，有弓背现象，被毛竖起。轻触大鼠皮毛或轻轻扣击其双下肢时发生嘶叫并有逃避行为，对抓捕反应敏感。对照组大鼠一般情况良好。

二、PWT变化

造模后大鼠PWT下降，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 造模后大鼠PWT变化

三、 前列腺组织病理学检测

模型组大鼠前列腺腺体形态不规则，部分腺上皮脱落，基底膜消失，间质可见较多淋巴细胞浸润，局部区域可见纤维组织增生，血管扩张充血（见图1）。对照组前列腺腺体形态规则，上皮结构完整，腔内较多粉染蛋白沉积物，间质无淋巴细胞浸润，见图1，图2。

图1 模型组炎症显著 (HE×100)

造模后前列腺呈现显著炎症反应，病变范围、间质淋巴细胞浸润都较对照组反应程度有所加重，差异有统计学意义（P＜0.05）, 见表2。

图2 对照组无炎症表现 (HE×100)

表2 造模后大鼠前列腺炎症变化

四、c-fos、TRPV1在前列腺与脊髓中的蛋白表达

c-fos阳性定位在前列腺上皮胞核内着棕黄色颗粒，间质不着色。模型组前列腺上皮大多数显c-fos阳性，沿腺上皮连续分布（见图3A）。对照组少许c-fos阳性，呈断续分布（见图3B）。

模型组脊髓c-fos 阳性细胞主要集中在脊髓浅层，Ⅰ层和Ⅱ层。阳性神经元呈多形性，圆形或卵圆形周围有突起（见图3C）。对照组脊髓背角无c-fos表达（见图3D）。

TRPV1阳性定位于前列腺上皮胞浆或胞膜，着棕黄色颗粒，间质不着色。模型组大多数显示TRPV1阳性表达，腺上皮呈广泛连续阳性显色（见图3E）。对照组前列腺少有阳性表达（见图3F）。两组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。

模型组TRPV1在脊髓背角浅层神经元细胞和小胶质细胞内表达，呈三角形、圆形、椭圆形，间质不表达（见图3G）。对照组脊髓背角TRPV1少有表达（见图3H）。

五、前列腺与脊髓中c-fos、TRPV1表达变化与相关性

与对照组相比，模型组前列腺与脊髓背角L5-S2中c-fos、TRPV1阳性表达均上调，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3、表4。

前列腺中与脊髓中的c-fos蛋白表达无相关关系（r=0.027，P=0.454）；与此同时，两者的TRPV1蛋白表达也无相关关系（r=0.000，P=0.5）。

讨 论

CNP疼痛一直以来都是男科与泌尿科急待解决的问题。Tripp等[5]认为CNP患者的健康相关生命质量评分，比糖尿病和充血性心力衰竭患者的还要低。有研究显示CNP疼痛部位与前列腺所在部位存在明显差距，为典型内脏痛；疼痛并不一定与组织损害和范围成比例，而且在感染控制的情况下疼痛仍可存在[6]，说明CNP疼痛的产生不一定是由前列腺本身病变引起，很可能与支配前列腺的神经传导通路和调控机制的异常有关，而这种异常与L5-S2脊髓节段的继发性病变有关[1]。

图3c-fos、TRPV1在各组大鼠前列腺及脊髓中的表达

表3 前列腺c-fos、TRPV1蛋白表达

表4 脊髓c-fos、TRPV1免疫组化表达

c-fos基因是一种细胞原癌基因，属于转录因子的早期即刻基因家族一员。研究发现缺氧、光、机械、疼痛等多种刺激因子可诱导中枢神经系统中c-fos基因的表达上调[7]。1987年Hunt等[8]率先证实，伤害性刺激可诱导大鼠脊髓背角产生大量fos蛋白。目前将c-fos作为一种细胞激活的标志和细胞活动定位的标记[9]。

本实验造模后前列腺呈现显著的炎症反应，检测大鼠PWT值降低，说明自身免疫法建立CNP模型成功。c-fos在模型组前列腺中表达上调，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05），提示c-fos在CNP大鼠炎症的形成中起了一定的作用。本实验观察到模型组脊髓背角神经元c-fos阳性表达上调，而且主要分布在脊髓背角Ⅰ层和Ⅱ层，其它层分布较少，提示c-fos阳性神经元的分布与传递外周伤害性信息的初级传入纤维和终末的终止部位相一致，这些二级神经元参与了疼痛信息的传导和调控。前列腺与脊髓背角c-fos表达均上调，但无相关关系，提示虽然炎症作为致痛因素参与了CNP疼痛的形成，但可能脊髓背角L5-S2节段的神经病理变化在疼痛过程中起着更重要作用。

Grey等[10]发现TRPV1基因缺失小鼠经角叉菜胶、完全弗氏佐剂、芥末油等致炎后对热刺激敏感增高不明显，但对机械刺激产生高敏感性；野生型小鼠致炎后，表现为对热和机械产生痛敏反应的潜伏期缩短，激活阈值降低，提示TRPV1参与了炎症诱导的热、机械刺激痛，但机械刺激痛还可能有其他传导通路。Bolcskei等[11]在糖尿病神经痛小鼠脚掌内注入PKC（蛋白激酶C）激活剂，发现小鼠产生明显痛觉防御行为，敲除TRPV1基因后，痛觉防御行为消失。

本实验模型组前列腺TRPV1表达上调，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05），提示TRPV1参与了CNP炎症的形成。造模后大鼠PWT降低，脊髓背角TRPV1表达上调，提示TRPV1可能通过脊髓神经元的显著上调，使脊髓神经元致敏，导致痛阈下降出现中枢敏化。前列腺与脊髓TRPV1表达均上调，但二者无相关关系，说明TRPV1在脊髓水平L5-S2节段通过合成增加进行中枢调控可能是CNP疼痛的重要因素之一。

综上所述，CNP疼痛可能分别通过c-fos、TRPV1脊髓水平的表达上调，参与背角L5-S2节段神经元病理性激活，降低痛阈，引起脊髓中枢痛觉敏化疼痛产生。但有关c-fos 与TRPV1在CNP疼痛神经传导与中枢调控中的深入关系有待于进一步研究。

1 Ishigooka M, Nakada T, Hashimoto T,et al. Spinal substance P immunoreactivity is enhanced by acute stimulation of the rat prostate.Urology2002; 59(1): 139-144

2 刘迎嘉, 张晨, 宋国宏, 等. COX2在慢性前列腺炎大鼠神经痛中变化的实验研究. 中国男科学杂志 2012; 26(7): 8-12

3 Chaplan SR, Bach FW, Pogrel JW,et a1. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw.J Neurosci Methods1994; 53(1): 55-63

4 徐叔云. 药理实验方法学. 第三版. 北京, 人民卫生出版社, 2003: 1558

5 Tripp DA, Curtis Nickel J, Landist JR,et al. Predictor of quality of life and pain in chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome:f ndings from the National Institute of Health Chronic Prostatitis Cohort Study.BJU Int2004; 94(9): 1279-1282

6 Herati AS, Moldwin RM. Alternative therapies in the management of chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome.World J Urol2013; 31(4): 761-766

7 Vanelzakker M, Fevurly RD, Breindel T,et al. Environmental novelty is associated with a selective increased in Fos expression in the output elements of the hippocampal formation and the perirhinal cortex.Learn Mem2008; 15(12): 899-908

8 Hunt SP, Pini A, Evan G. Induction of C-fos-like protein inspinal cord neurons following sensory stimulation.Nature1987; 328(6131): 632-634

9 Day HE, Kryskow EM, Nyhuis TJ,et al.Conditioned fear inhibits c-fos mRNA expression in the central extended amygdale.Brain2008; 1229: 137-146

10 Grey C, Mery A, Puceat M. Fine-tuning in Ca2+homeostasis underlines progression of cardiomyopathy in myocytes derived from genetically modif ed embryonic stem cells.Hum Mol Genet2005; 14(10): 1367-1377

11 Bolcskei K, Helyes Z, Szabo A,et al. Investigation of the role of TRPV1 receptors in acute and chronic nociceptive processes using gene-def cient mice.Pain2005; 117(3): 368-376

（2014-04-20收稿）

Study on the role of c-fos and TRPV1 in neuralgia of rats with chronic prostatitis*

Liu Yingjia1, Zhang Chen1, Song Guohong2**
1. Department of Pathology, Fifth Aff liated Hospital, Xinjiang Medical University, Urumuqi 830011, China; 2. Department of Triditonal Chinese Medicine, Fifth Aff liated Hospital, Xinjiang Medical University

Song Guohong, E-mail: songguohong69@sina.com

ObjectiveTo explore the possible mechanisms of chronic nonbacterial prostatitis pain.MethodsThe CNP rat model was established by the immune method. The pain threshold were detected by Von Frey filament. The expressions of c-fos and TRPV1 in the prostate and spinal L5- S2 segmental were detected by immunohistochemistry.ResultsThe PWT of rat model group was signif cantly decreased as compared with that of the control group (P<0.05). There were significant inflammation in prostate tissues of rats. The differences in the scope of lesions and interstitial lymphocytic inf ltrates were statistically signif cant between model group and the control group (P<0.05). The expressions of c-fos and TRPV1 in prostate and spinal cord dorsal horn L5 - S2 in model group were all upregulated remarkably compared with that of the control group (P<0.05). The expression of c-fos and TRPV1 in the prostate had no correlation with that in spinal cord (r=0.027，P=0.454;r= 0.000,P= 0.000).ConclusionFormation of the pain in rats may be associated with upregulation of c-fos and TRPV1 in the spinal L5 - S2 section.

transient receptor potential ion channel protein-1; c-fos; neuralgia; prostatitis

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.07.003

R 697.33

资助: 国家自然科学基金资助项目（No：81060321）
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, E-mail: songguohong69@sina.com