无精子症、重度少弱精子症患者染色体核型与Y染色体微缺失发生率的研究*

张雅君 卢 实刘 琳 王 珊 李璐璐 潘蕴苏 高 颖

华中科技大学同济医学院附属协和医院生殖中心（湖北武汉 430022）

无精子症、重度少弱精子症患者染色体核型与Y染色体微缺失发生率的研究*

张雅君 卢 实**刘 琳 王 珊 李璐璐 潘蕴苏 高 颖

华中科技大学同济医学院附属协和医院生殖中心（湖北武汉 430022）

目的探讨染色体核型异常与男性无精子症、重度少弱精子症的关系。方法对2011年1月至2013年10月来我院生殖中心要求助孕的445例无精子症、147例重度少弱精子症患者，采用外周血常规染色体制备方法对染色体进行核型分析，并采用聚合酶链反应对122例Y染色体进行AZF微缺失检测，283例不育症患者进行睾丸/附睾穿刺取精检查。结果445例无精子症者检出染色体核型异常率为38.65%，分别为性染色体异常22.7%，常染色体异常6.52%、染色体多态性9.43%；147例重度少弱精子症者染色体异常率7.48%；与对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.01）。8例Y染色体AZF微缺失位点为AZFa（SY 84，SY 86），AZFb（SY 127，SY 134），AZFc（SY254，SY 255）。结论 无精子症、重度少弱精子症与染色体核型异常及Y 染色体微缺失密切相关，有必要在提供辅助生殖技术之前进行遗传学检查。

无精子症; 少精子症; 弱精子症; 染色体, 人, Y; 性染色体畸变

男性不育是指未采取任何避孕措施有正常性生活1年以上，因男方因素女方未妊娠。全世界范围内约15%的夫妇不育不孕，其中50%与男方因素有关[1]。无精子症和少弱精子症是男性不育的主要原因之一，染色体遗传因素异常能导致男性无精子症或重度少弱精子症[2]，Y染色体微缺失也与男性不育有一定关系[3]。国内外文献报道无精子症中染色体异常率为12.5%～31%[4]，重度少弱精子症中染色体异常率为1.1%～13.3%[5]。本研究旨在探讨染色体核型、Y 染色体微缺失与无精子症、重度少弱精子症的关系。

资料和方法

一、一般资料

选择2011年1月至2013年10月来我院生殖中心要求助孕的无精子症患者445例和重度少弱精子症患者147例，年龄24～50岁，平均年龄（32.76±5.23）岁；不育年限1～20年，平均（4.35±3.7）年。每名患者详询病史及生育史，排除外伤史和家族遗传病史，排除女方不孕因素，经皮睾丸穿刺精子抽吸术/经皮附睾穿刺精子抽吸术（TESA/PESA）者穿刺之前行生殖器体格检查。对照组为同期年龄相当、已有生育史或精液常规检查正常的健康男性40例。

二、方法

（一）精液分析

排精后2～7d手淫法收集精液，手工精液分析参照世界卫生组织（WHO）标准指南，所有病例均常规进行至少2次以上的精液分析检查。镜下检查未见精子者的精液3000×g，离心15min沉淀后仍未发现精子者为无精子症，并排除逆向射精；精子浓度＜5×106/mL为重度少精子症，精子活动率a+b＜10%为重度弱精子症。同时兼有两项异常者，为严重少弱精子症。

（二）染色体检查

外周血染色体常规制备方法对染色体进行核型分析，G显带分析计数20个中期分裂象，分析5个细胞核型，异常核型则增加分析倍数，根据《人类细胞遗传学国际命名体制》描述染色体异常核型。

（三）Y染色体微缺失检测

从外周血淋巴细胞提取DNA，参考欧洲生殖协会（EAA）2004版指导原则和EMQN标准，选择Y染色体微缺失6个位点设计引物，6个选择位点分别是AZFa（SY 84，SY 86）、AZFb（SY 127，SY 134）和AZFc（SY 254，SY 255 ），以SRY的扩增作为PCR质控对照，正常男性的DNA与患者DNA同时进行以上各位点的单重PCR扩增后电泳检查PCR扩增产物。PCR试剂盒购自美国Omega公司。

（四）睾丸/附睾穿刺

会阴局部皮肤消毒，检查睾丸寻找穿刺位点，用注射器连接7号头皮针经皮直接穿刺抽吸睾丸生精小管组织寻找活动精子；若一侧睾丸穿刺取精失败则检查对侧睾丸穿刺取精；以上均失败则用注射器连接5号半头皮针经皮直接穿刺附睾组织饱满处抽吸附睾液寻找活动精子。

（五）统计学方法

利用SPSS17.0软件统计分析，使用四格表和行x列表的卡方检验，P＜0.05为有统计学意义。

结 果

一、染色体异常核型检出率及分布

445例无精子症者检出异常核型染色体172例（38.65%），分别为性染色体异常101例（22.7%）、其中克氏综合症有84例（18.88%），常染色体异常29例（6.52%），染色体多态性42例（9.43%），见表1。147例重度少弱精子症者检出异常核型染色体11例（7.48%），分别为性染色体异常2例（1.36%）、常染色体异常2例（1.36%）、染色体多态性7例（4.76%），见表2。40例对照组中检出1例染色体多态性。3组间异常核型染色体检出率有显著统计学差异（P＜0.01）。

二、Y染色体微缺失

共检查122例，其中：选择男方染色体检测为46,XY，无明确病因的无精子症患者102例（均排除女方不孕因素），进行AZF微缺失检查，发现有8例无精子症患者的Y染色体分别在AZFa（SY 84，SY 86）、AZFb（SY 127，SY 134）或AZF c（SY 254，SY 255）有微缺失位；20例核型为46, XY的重度少弱精子未发现Y染色体微缺失。

三、梗阻性、非梗阻性无精子症与染色体异常

445例无精子症患者经过体格检查有283例进行睾丸或附睾穿刺。213例穿刺取出精子，其中染色体核型正常者204例（95.77%），染色体核型异常者9例（4.23%），分别为2例46XY,小Y、46XY, 22pstk+、46XY,15pstk+ 、46XY,15p+mar、46XY,9qh+、47XXY、46X,Yqh+和46XY,t（2; 21; 5）（p21; q11.2;q22）；70例穿刺未取出精子，其中染色体核型正常者51例（72.86%），染色体核型异常者19例（27.14%），分别为47,XXY 8例，47,XYY、46,XX、45XY, t（14;15）（q10;q10）、46X, del（Y）、46XY, del（13）（q31→qter）、46XY,Y染色体AZFc区微缺失、46XY, 16h+、46XY, 1qh+、46XY, Yqh-和2例46XY, 小Y。

表1 无精子症患者染色体异常核型分类及分布

表2 重度少弱精子症染色体异常核型分类及分布

讨 论

染色体异常是引起男性生精功能障碍的重要原因，尤其是性染色体异常。本文中无精子症患者异常核型染色体检出率38.65%，显著高于重度少弱精子症患者的异常核型染色体检出率7.48%和对照组的异常核型染色体率2.5%，并且无精子症中染色体异常核型主要表现为性染色体异常，重度少弱精子症者则主要表现为染色体多态性，结果表明染色体异常核型检出率越高，精液质量越差；性染色体异常是无精子症的重要原因之一，染色体多态性会影响生精功能，这与其他一些文献报导相符[6,7]。此外，睾丸/附睾穿刺取出精子的9例异常核型染色体中7例为染色体多态性，9例患者双侧睾丸平均体积为17mL；穿刺未取出精子的19例异常核型染色体中13例为性染色体或常染色体异常，19例患者双侧睾丸平均体积为13mL，这也表明与染色体多态性相比，性染色体异常、常染色体异常对男性不育的影响更严重。

克氏综合征（klinefelter综合征），又称先天性曲细精管发育不全，是一种性染色体异常的先天性疾病，发病率在男性不育症患者中占3.1%[8]，其最常见的核型是47, XXY，染色体核型特征是出现两条或两条以上的X染色体，多由异常的XX卵子与一个正常的Y精子结合，或由正常的X卵子与一个异常的XY精子结合产生，推测是卵子或精子发生减数分裂时染色体未分离，或早期受精卵在有丝分裂时染色体未分离，从而导致子代多出一条X染色体[9]。本文445例无精子症患者中检出84例47, XXY，占无精子症患者的18.88%，显著高于在男性不育症患者中的发病率，分析原因可能是来本中心要求助孕的无精子症患者人群过于集中，也并不是每一位男性不育症患者都进行染色体检测，有明确的其他原因诸如内分泌异常或免疫因素导致的不育症患者没有进行染色体检查，从而出现克氏综合征检出率增高。本文中部分克氏综合征患者的穿刺结果显示镜下可见支持细胞、间质细胞，未见精原细胞、精母细胞、精子细胞及精子；超声检查双侧睾丸偏小，部分患者有附睾囊肿、睾丸微石症或精索鞘膜积液等，显现此类患者生精细胞的缺失及表型的异常。

Y染色体微缺失遗传给男性子代的风险几乎为100%[10]，进一步对Y染色体无精子因子AZF微缺失位点观察发现：AZFc微缺失发生频率较AZFa、AZFb高。本文中选择的染色体正常的102例无精子症患者有8例存在Y染色微缺失，其中AZFa 1例、AZFb 2例、AZFc 3例、AZFb+AZFc 2例，有2例AZFc微缺失患者睾丸穿刺检查结果为生精小管内未见各级生精细胞，超声检查也发现双侧睾丸体积稍小。Y染色体AZFa区微缺失表现以唯支持细胞综合征，AZFb区微缺失表现为精子成熟障碍[11]， AZFc微缺失可残留岛状的生精正常区域[12]；AZFc微缺失率较AZFa、AZFb高[13]。但本研究中20例重度少弱精子症患者未发现Y染色体微缺失，可能是由于检查例数较少、选择的患者是46XY正常核型者而未能检测到Y染色体微缺失，下一步需要检测染色体核型异常的重度少弱精子症患者的Y染色体微缺失；也不排除与以下因素有关：如位于3号常染色体的DAZLA基因缺失可造成隐性男性不育[14]；一些酶的异常也可造成AZF基因表达过程异常[15]，而未检测到AZF微缺失。

综上所述，无精子症、重度少弱精与染色体核型密切相关，与Y染色体微缺失有一定关系，对于男性不育症患者在提供辅助生殖技术之前进行染色体核型分析、Y染色体微缺失检查是非常必要的。

1 Quilter CR, Svennevik EC, Serhal P,et al. Cytogenetic and Y chromosome microdeletion screening of a random group of infertile males.Fertil Steril2003;79 (2): 301-307

2 Whitman-Elia GF, Baxley EG.et al. A primary care approach to the infertile couple.J Am Board Fam Pract2001; 14 (1): 33-45

3 Al-Achkar W, Wafa A, Moassass F. Cytogenetic abnormalities and Y-chromosome microdeletions in infertile Syrian males.Biomed Rep2013; 1(2): 275-279

4 Kosar PA, Ozcelik N, Kosar A. Cytogenetic abnormalities detected in patients with non-obstructive azoospermia and severe oligozoospermia.J Assist Reprod Genet2010; 27 (1): 17-21

5 Zhang ZB, Jiang YT, Yun X,et al.Male infertility in Northeast China: a cytogenetic study of 135 patients with non-obstructive azoospermia and severe oligozoospermia.J Assist Reprod Genet2012; 29 (1): 83-87

6 何家超, 张名扬, 谢章平, 等. 染色体畸变与男性不育关系的探讨: 附1397例检测结果分析. 中国优生与遗传杂志 2007; 15 (12): 38-40

7 Lissitsina J, Mikelsaar R, Punab M. Cytogenetic analyses in infertile men.Arch Androl2006; 52(2): 91-95

8 Oates RD. Clinical and diagnostic features of patients with suspected Klinefelter syndrome.J Androl2003; 24(1): 49-50

9 田莉, 张建武, 沈长新, 等. 1例嵌合型Klinefelter综合征患者细胞与分子遗传学研究. 中华男科学杂志 2012;18(6): 545-550

10 Oates RD, Silber S, Brown LG,et al.Clinical characterization of 42 oligospermic or azoospermic men with microdeletion of the AZFc region of the Y chromosome, and of 18 children conceived via ICSI.Hum Reprod2002; 17(11): 2813-2824

11 Martinez-Garza SG, Gallegos-Rivas MC, Vargas-Maciel M,et al.Genetic screening in infertile Mexican men: chromosomal abnormalities, Y chromosome deletions, and androgen receptor CAG repeat length.J Androl2008; 29(6): 654-660

12 Maurer B, Simoni M. Y chromosome microdeletion screening in infertile men.J Endocrinol Invest2000; 23(10): 664-670

13 Sawai H, Komori S, Koyama K. Molecular analysis of the Y chromosome AZFc region in Japanese infertile males with spermatogenic defects.Journal of Reproductive Immunology2002; 539(1-2) :37-44

14 Seboun E, Barbaux S, Bourqeron T,et al. Gene Sequence, Localization, and Evolutionary Conservation of DAZLA, a Candidate Male Sterility Gene.Genomics1997; 41(2): 227-235

15 Dasari VK, Deng D, Perinchery G,et al. DNA methylation regulates the expression of Y chromosome specif c genes in prostate cancer.J Urol2002; 167(1): 335-338

（2014-04-08收稿）

The frequency of chromosome abnormality and Yq microdeletions in infertile men with azoospermia or severe oligoasthenospermia*

Zhang Yajun, Lu Shi**, Liu Lin, Wang Shan, Li Lulu, Pan Yunsu, Gao Yin Reproductive Center of Union Hospital ,Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan,
430022, Hubei, China

Lu Shi, Email: lushii@sina.com; Tel: 027-85351593

ObjectiveTo detect the frequency and types of chromosomal anomalies for infertile men with azoospermia and severe oligozoospermia.Methods445 cases of azoospermia and 147 cases of severe oligozoospermia patients in our reproductive center were recruited from January 2011 to October 2013. Karyotype analysis was performed in peripheral blood lymphocytes using standard G-banding. Y chromosome AZF microdeletions were detected using PCR . Testicular sperm retrieval puncture were done in 283 infertility men.ResultsThe frequency of chromosomal abnormalities of azoospermia patients was 38.65%, including sex chromosomes abnormalities (22.7%), autosomals abnormalities (6.52%) and chromosome polymorphism abnormalities (9.43%). The frequency of chromosomal abnormalities of serve oligozoospermia patients was 7.48%. Both abnormal chromosome rates of azoospermia and severe oligoasthenospermia group were signif cant differences compared with that of the control group (P<0.01). Eight cases of AZF microdeletions sites were AZFa(SY 84 SY 86)，AZFb(SY 127 SY 134)，AZFc(SY254 SY 255).ConclusionChromosome analysis is a necessary routine genetic testing, chromosome anomalies and Yq microdeletions may be associated with azoospermia and severe oligozoospermia in infertile men.

azoospermia; oligospermia; asthenozoospermia; chromosomes, human, Y; sex chromosome aberrations

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.07.011

R 698.2

资助: 国家“十二五科技支撑”计划（2012BAI32B03）; 武汉市人口和计划生育科研计划（2009WRJK0909）
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, E-mail: lushii@sina.com; Tel: 027-85351593