补肾生精汤对铅损伤小鼠生精细胞凋亡的影响*

田洪艳 李质馨徐 冶 王弘珺 林冬静 潘晓燕 金玉姬 刘忠平 孙 奇吉林医药学院组织学与胚胎学教研室（吉林 132013）

补肾生精汤对铅损伤小鼠生精细胞凋亡的影响*

田洪艳 李质馨**徐 冶 王弘珺 林冬静 潘晓燕 金玉姬 刘忠平 孙 奇吉林医药学院组织学与胚胎学教研室（吉林 132013）

目的探讨补肾生精汤对铅损伤小鼠生精细胞凋亡的影响，为临床治疗重金属所致男性不育提供理论依据。方法成年健康清洁级ICR雄性小鼠30只，随机分为对照组、模型组和给药组，每组10只。醋酸铅灌胃建立睾丸损伤模型（30mg/kg体质量，0.1ml/10g容积），采用中药补肾生精汤灌胃治疗（15.0g/kg，即25mL/kg体质量），每天1次，共28d。TUNEL法检测细胞凋亡情况，共聚焦激光扫描显微镜观察；JC-1染色法检测线粒体膜电位变化情况，NucleoCounter NC-3000TM对线粒体膜电位进行分析。结果TUNEL法检测，模型组凋亡细胞数量（11.60±2.01）明显高于对照组（1.20±1.03）（P＜0.01），阳性细胞多发生于精原细胞和精母细胞的位置；给药组凋亡细胞数（3.40±1.78）明显低于模型组（P＜0.01）。JC-1染色法检测，模型组去极化细胞（凋亡细胞）比例为（74.20%±1.3038），明显高于对照组（31.80%±0.8367）（P＜0.01）；给药组去极化细胞比例为（54.20%± 1.3038），低于模型组（P＜0.01）。结论 补肾生精汤可通过抑制生精细胞凋亡而改善铅损伤小鼠的生精功能。

补肾生精汤; 铅; 生精上皮; 细胞凋亡

随着全球工业化的进程，环境中铅等重金属对人类生殖健康的威胁已日趋严重[1]。睾丸是铅毒作用的靶器官[2]。有研究发现，铅可透过血-睾屏障在睾丸内蓄积，诱发产生活性氧自由基，使睾丸组织发生脂质过氧化作用，直接损伤生精细胞的结构或诱导生精细胞凋亡，导致精子数量减少、质量下降、畸形率升高[3]，最终导致男性不育，其修复及保护机制一直是临床及基础研究的重点。补肾生精汤是以“肾主生殖”为理论基础，精心筛选、配伍创立的中药复方，经多年临床实践证明，对少弱精子症有显著疗效。本研究采用补肾生精汤对铅所致生精功能损伤小鼠进行治疗，研究其在细胞凋亡中的作用，为临床治疗重金属损伤所致男性不育提供理论依据。

材料与方法

一、材料

（一）实验动物

清洁级健康雄性ICR小鼠30只，体质量（25 ±2）g，购于吉林大学动物实验中心，许可证号为SCXK-（吉）2007-0003。随机分为对照组、模型组、给药组，每组10只，分笼饲养，饲养温度18℃～22℃，相对湿度45%～55%，规律光照，自由饮食，适应性饲养1周后开始实验。

（二）试剂及仪器

醋酸铅，温州市化学用料厂；多聚甲醛，国药集团化学试剂有限公司；细胞凋亡检测试剂盒，武汉博士德公司。Leica-RM 2245石蜡切片机，德国；Olympus-FV1000激光共聚焦扫描显微镜，日本；细胞筛，南京生物技术有限公司；TD-SA型离心机，河南凯达科学仪器有限公司；NucleoCounter NC-3000TM线粒体膜电位检测仪，丹麦。

（三）药品制备

补肾生精汤配方：人参25g，鹿茸10g，鹿角胶30g，枸杞子50g，海狗肾1对（约60g），鹿鞭（30g），阳起石40g，淫羊藿50g，锁阳30g，熟地40g，菟丝子40g，牛膝30g，当归30g，川芎30g，酒白芍30g，蜈蚣10条（约50g），甘草梢25g。以上药物购自吉林江城大药房。将补肾生精汤方药按照传统方法水煎成剂，浓度为0.6g/mL。将煎药装入无菌消毒的食品容器内，室温冷却，-20℃储存。

二、实验方法

（一）模型制备

每日早8:00，根据文献资料记载的染毒剂量[4]，模型组以0.4%醋酸铅灌胃染毒1次（30mg/kg体质量，0.1mL/10g容积）；给药组以0.4%醋酸铅灌胃（30mg/kg体质量，0.1mL/10g容积）；对照组给予与前两组等剂量的0.9%生理盐水灌胃。连续28d。

（二）治疗方法

造模同日下午2:00进行。将补肾生精汤置于室温融化，充分震荡摇匀。参考临床成人用量为体质量70kg，每日200mL，折合生药1.68g/kg，每kg体质量2.8mL。根据人与小鼠剂量换算关系，小鼠用药剂量为每日1.68g/kg×9.01≈15.0g/kg体质量，即每kg体质量25mL。给药组以每日每kg体质量15.0g（25mL）灌胃进行治疗；对照组和模型组灌胃给予0.9%生理盐水每kg体质量25mL，连续28d。

（三）标本制备

每组取5只小鼠，乙醚麻醉，打开胸腔，暴露心脏，用4%多聚甲醛进行心脏灌流固定；待小鼠四肢、尾部僵直后，取睾丸；制备石蜡切片，进行细胞凋亡检测。每组剩余5只小鼠，脱臼处死，取两侧睾丸，剪开白膜，用注射器芯剥出生精小管置于100目细胞筛上（细胞筛置于盛有1 mL PBS的平皿内），其上铺100目尼龙网，用注射器芯在尼龙网上轻轻研磨，并将研磨物吹入平皿液体内；将平皿内液体经300目细胞筛过滤；滤液离心150×g，5min，离心2次，去掉上清液，收集细胞，加PBS 1mL轻轻吹打，混匀细胞，细胞密度约2.5×106，采用NucleoCounter NC-3000TM对细胞线粒体膜电位进行检测。

（四）生精细胞凋亡检测

采用TUNEL法进行细胞凋亡检测，染色步骤按试剂盒说明书进行，阴性对照以PBS代替末端脱氧核糖核酸转移酶（TdT）反应液，荧光素标记，共聚焦激光扫描显微镜下观察，胞核呈黄绿色为阳性。每组随机选取30个视野（×100），计数凋亡细胞数。

（五）细胞线粒体膜电位检测

采用JC-1亲脂性阳离子染料对细胞进行染色，NucleoCounter NC-3000TM对线粒体膜电位进行分析。健康细胞膜完整，线粒体膜电位高，JC-1染料聚集在膜上，呈现红色荧光；凋亡细胞膜通透性增加，线粒体膜电位低，JC-1以单体形式进入基质中，呈现绿色荧光。利用红色荧光和绿色荧光的强度比来判断细胞的线粒体膜电位是否发生了去极化，是否发生凋亡。每组5个样本，检测去极化细胞比例。

三、统计学方法

应用SPSS17.0统计软件处理，数据采用平均值±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，P＜0.05表示具有统计学意义。

结 果

一、生精细胞凋亡检测

TUNEL法染色，共聚焦激光扫描显微镜观察，阳性凋亡细胞核呈圆形或椭圆形，发出明亮的黄绿色荧光，背景呈浅绿色。对照组生精细胞中只见少数散在分布的凋亡细胞（凋亡细胞数1.20±1.03）（图1A）；模型组凋亡细胞数量（11.60±2.01）明显高于对照组（P＜0.01），阳性细胞多发生于精原细胞和精母细胞的位置（图1B）；给药组凋亡细胞数量（3.40±1.78）明显低于模型组（P＜0.01）（图1C）。

二、细胞线粒体膜电位检测

JC-1染色，Nucleocounter NC-3000TM检测分析，健康细胞呈现红色荧光，凋亡细胞呈现绿色荧光，利用红色荧光和绿色荧光的强度比判断细胞的线粒体膜电位是否发生去极化，是否发生凋亡。图2所示，模型组（图2B）去极化细胞（凋亡细胞）比例为（74.20%±1.3038），明显高于对照组（图2A）（31.80%±0.8367）（P＜0.01）；给药组（图2C）去极化细胞（凋亡细胞）比例为（54.20%±1.3038），低于模型组（P＜0.01）。

图1 共聚焦激光扫描显微镜对睾丸生精细胞凋亡的检测

图2 Nucleocounter NC3000TM对线粒体膜电位的检测

讨 论

环境因素所致生殖障碍和睾丸萎缩的主要原因是生殖细胞凋亡[5]。铅等重金属是较早被认识的凋亡诱导因子之一[6]。具有环境雌激素样作用的重金属通过雌激素受体等信号传导系统产生生物学效应，最终导致生精细胞凋亡紊乱，精子数量和质量下降，影响生殖功能[7]。环境铅污染不仅可致生殖系统损伤，也可造成人体肝、肾等多系统、多脏器的损害[8]。因此，对生殖系统损伤的治疗不能只单一针对生殖系统，应开展全身的系统治疗，而中医中药在该方面具有辨证论治、治病求本的独特优势。

中药复方是祖国医药宝库的重要组成部分，是中医扶正祛邪、辨证论治的集中体现，其君臣佐使等配伍的独特规律及疗效的优越性已为数千年的临床实践所证实。本研究采用的补肾生精汤源自于“肾主生殖”理论，该理论是中医脏象学说对人体生殖功能、生理病理的基本认识。肾藏精是肾主生殖的基础，是肾的重要功能之一，《素问·六节脏象论》指出肾为“封藏之本”，主要就是体现肾的藏精作用。肾藏先天之精即生殖之精，禀受于父母，与人的生育繁殖有关。肾是先天的根本，接受其他脏腑的精气而储藏起来，五脏的精气充旺，肾精的生成、储藏和排泄才能保持正常。大量临床实践表明，补肾中药能够通过补肾生精而调节生殖功能[9]。补肾生精汤方药中，人参、鹿茸补肾益精为君药；鹿角胶、枸杞子温补肝肾、益精养血，海狗肾、鹿鞭暖肾壮阳、益精补髓，阳起石、淫羊藿、锁阳温肾壮阳，熟地、菟丝子补精益髓，共为臣药；牛膝补肝肾、引经下行，当归、川芎补血活血、调众脉，酒白芍养血柔肝、敛阴收汗，蜈蚣攻毒散结、通络止痛，共为佐药；甘草通十二经、调和诸药为使药。研究显示，铅损伤模型组睾丸凋亡细胞数量明显高于对照组，阳性细胞多发生于精原细胞和精母细胞的位置；给药组凋亡细胞数明显低于模型组。线粒体膜电位分析，模型组去极化细胞（凋亡细胞）比例明显高于对照组；给药组去极化细胞（凋亡细胞）比例低于模型组。研究结果提示，补肾生精汤可通过抑制睾丸细胞过度凋亡而拮抗铅对生殖系统的损伤。

综上所述，补肾生精汤可通过补肾生精途径抑制铅对生精细胞的凋亡诱导作用，拮抗铅对生殖系统的损害。但是，补肾生精汤在凋亡信号传导途径中的确切作用机制还有待进一步探讨。总之，深入研究补肾生精汤在细胞、分子水平上的作用机制，有助于临床治疗重金属损伤引起的男性不育，从而为治疗男性不育症提供新思路，同时也为铅作业男性提供有效的防护措施。

1 Liberatori R, Romeo R, Restieri R, et al. Acute inorganic lead poisoning in workers employed on building renovation.Med Lav2010; 101(5): 335-340

2 付占海, 常云飞, 姜翠玲, 等. 褐藻胶抗铅污染对雄性小鼠生殖的影响. 中国男科学杂志 2013; 27(5): 6-8, 13

3 Chung YM, Bae YS, Lee SY. Molecular ordering of ROS production, mitochondrial changes and caspase activation during sodium salicylate-iduced apoptosis.Free Radic Biol Med2003; 34(4): 434-442

4 孙国安, 宋波, 张荣, 等. 铅和乙醇对雄性小鼠初级精母细胞的致突变性研究. 河北医科大学学报 2008; 29(5): 688-690

5 Henriksen K, Kulmala J, Toppari J,et al. Stage-specif c apoptosis in the rat seminiferous epithelium: quantif cation of irradiation effects.J Androl1996; 17(4): 394-402

6 Wolfe JT, Ross D, Cohen GM. A role for metal and free radicals in the induction of apoptosis in thymocytes.FEBS Lett1994; 352(1): 58-62

7 王随心, 张玉华, 李向阳, 等. 重金属生精细胞毒性研究进展. 环境与健康杂志 2011; 28(4): 367-372

8 马威, 王芳, 吴文莉, 等. 低浓度铅接触大鼠海马突触损伤和学习记忆能力改变及中药的干预作用. 中国儿童保健杂志 2007; 15(4): 378-381

9 黄琼霞. “肾主生殖”的临床及实验研究概况. 湖北中医杂志 2005; 27(3): 53-54

（2014-01-10收稿）

Effects of Bu Shen Sheng Jing Tang on apoptosis of spermatogenic cells in lead-treated mice*

Tian Hongyan, Li Zhixin**, Xu Ye, Wang Hongjun, Lin Dongjing, Pan Xiaoyan, Jin Yuji, Liu Zhongping, Sun Qi
Department of Histology and Embryology,Jilin Medical College, Jilin 132013,China

Li Zhixin,E-mail:lzx-62@163.com

ObjectiveTo investigate the effects of Bu Shen Sheng Jing Tang on apoptosis of spermatogenic cells in lead-treated mice, and establish the theoretical basis for clinical treatment of male infertility induced by heavy metals .MethodsTotal of 30 adult male ICR mice were randomly divided into three groups such as the control group, the model group and the treated group. Testis-injuried model was made by intragastric administration of lead acetate(30mg•kg-1, 0.1ml•10g-1). Mice in the treated group received intragastric administration of lead acetate and Bu Shen Sheng Jing Tang (15.0g•kg-1, 25mL•kg-1) at the same time for 28days. Mice in the control group received the same amount of 0.9% NaCl by intragastric administration as well. Apoptosis was examined with TUNEL and observed under the confocal laser scanning microscope. Mitochondrial potential was examined with JC-1 and analyzed by NucleoCounter NC-3000TM.ResultsThe number of apoptosis cells(3.40±1.78) in the treated group was lower than that in the model group(11.60±2.01)(P<0.01), moreover the number of apoptosis cells of these two groups were all higher than that of the control group. The rate of depolarization cells(apoptosis cells) (54.20%±1.3038) was lower than that in the model group (74.20%±1.3038) (P<0.01).ConclusionThe results suggest that Bu Shen Sheng Jing Tang supplementation protects the testicular spermatogenisis of lead-treated mice by inhibiting spermatogenic cells apoptosis.

Bu Shen Sheng Jing Tang; lead; seminiferous epithelium; apoptosis

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.07.004

R321.1

资助: 吉林省教育厅科学技术研究项目（课题编号2012485，2012484）
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