白芷总香豆素、川芎嗪及配伍应用对大鼠脑缺血/再灌注损伤的影响*

钟佩茹，张方亮，何丽娜，刘莎莎，樊耀文，何 新

（天津中医药大学中药学院，天津 300193）

·中药研究·

白芷总香豆素、川芎嗪及配伍应用对大鼠脑缺血/再灌注损伤的影响*

钟佩茹，张方亮，何丽娜，刘莎莎，樊耀文，何 新

（天津中医药大学中药学院，天津 300193）

[目的]探讨白芷总香豆素、川芎嗪及二者配伍应用对大鼠脑缺血/再灌注损伤的保护作用及机制。[方法]实验分为假手术组、缺血再灌注组、川芎嗪（7．5 mg/kg）组、白芷总香豆素组（50 mg/kg）、川芎嗪-白芷总香豆素（7．5 mg/kg+ 50 mg/kg）组、尼莫地平（10 mg/kg）组。连续灌胃给药7 d后，采用线栓法建立大鼠大脑中动脉栓塞（MCAO）脑缺血/再灌注损伤模型。缺血2 h再灌注22 h后进行神经功能缺失症状评分，红四氮唑（TTC）染色法检测脑梗死体积，制备脑组织匀浆测定超氧化物歧化酶（SOD）活力和丙二醛（MDA）含量。[结果]与缺血再灌注组相比，川芎嗪、白芷总香豆素及配伍应用能明显改善大鼠受损的神经功能障碍（P＜0．05），提高SOD的活力（P＜0．01，P＜0．05，P＜0．01），降低MDA的含量（P＜0．01），川芎嗪-白芷总香豆素组显著缩小梗死体积（P＜0．05）。[结论]白芷总香豆素、川芎嗪及配伍使用对大鼠脑缺血/再灌注损伤都有明显保护作用，可能与抑制脑组织脂质过氧化反应相关。

白芷总香豆素；川芎嗪；脑缺血/再灌注；脂质过氧化；超氧化物歧化酶；丙二醛

脑缺血/再灌注导致脑梗死，属于中风病范畴，具有高致残率和病死率，是严重危害人类健康的主要疾病之一。氧自由基的产生增加与脑缺血/再灌注损伤密切相关，其水平高低决定了脑组织损伤的严重程度。清除氧自由基，减轻脑组织损伤的治疗措施，具有重要的临床意义[1]。

白芷（Radix Angelicaedahuricae）为临床常用药物，具有通窍止痛、散风除湿等功效，主要以复方形式出现，其中与川芎的伍用见于多种方药[2]。白芷香豆素是其主要有效成分，目前研究表明白芷香豆素具有抗炎、镇痛和解痉等作用[3-4]。川芎嗪作为中药川芎的有效成分，具有抗脑缺血/再灌注损伤作用[5-6]，临床主要用于脑血管疾病的治疗。因此，本实验建立大鼠脑缺血/再灌注损伤模型，研究白芷总香豆素以及与川芎嗪配伍应用对脑损伤的保护作用。通过氧自由基水平的改变，探讨白芷总香豆素与川芎嗪伍用的药理学作用机制。

1 材料

1.1 动物 清洁级SD大鼠，雄性，体质量250～320g，购于天津市山川红实验动物科技有限公司，合格证号0004112。

1.2 试剂与药品 白芷总香豆素提取物（TCE），本实验室自制，经HPLC法检测，欧前胡素、异欧前胡素以及水合氧化前胡素等总香豆素含量高于52%。盐酸川芎嗪（TMP，南京泽朗医药科技有限公司，纯度高于98%），尼莫地平（Nimodipine，中国药品生物制品检定所，批号100270-20002），氯化-2,3,5-三苯基四氮唑（TTC，Sigma公司，批号20130322），BCA试剂盒（上海碧云天生物技术研究所，批号20130425），超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20121208），丙二醛（MDA）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20121208）。

1.3 仪器 Flexstation3多功能读板机（新加坡Santak公司），ALLEGRA-64R高速离心机（美国Beckman公司），WH-3微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司），AX205十万分之一天平（瑞士Mettler Toledo公司），96孔透明板（Corning公司），A5级线栓（北京沙东生物技术有限公司）。

2 方法

2.1 大鼠分组与局灶性脑缺血/再灌注损伤模型的制备

2.1.1 动物分组及给药 采用随机函数所产生随机数的方法将大鼠随机分为6组：假手术组[Sham组，5%羧甲基糖淀粉素钠（CMA-Na）]，缺血再灌注组[I/R组，5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）]，川芎嗪组（TMP组，7．5 mg/kg TMP），白芷总香豆素组（TCE组，50 mg/kg TCE），川芎嗪-白芷总香豆素配伍组（TMP-TCE组，7．5mg/kgTMP+50mg/kgTCE），尼莫地平组（Nimodipine组，10 mg/kg Nimodipine）。各组大鼠灌胃容积为20 mL/kg。

2.1.2 模型制备 各组大鼠连续灌胃给药7 d后，于末次给药前12 h，禁食自由饮水。并于末次给药30 min后，以10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉动物，参照Longa[7]等建立的方法制备大鼠线栓法大脑中动脉栓塞（MCAO）模型。假手术组只分离出血管，不做结扎以及插线处理。模型制备的具体操作步骤如下：游离右侧颈总动脉（CCA），分离颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）。于分叉处附近的CCA剪一切口，将长约5 cm，直径0．235 mm线栓从剪口处插入，沿着ICA走向轻柔推进，约进入（18．5±0．5）mm，感到阻力即停止，缺血2 h后拔出线栓，结扎CCA，缝合皮肤，实现22 h再灌注。于缺血再灌注24 h后，进行神经功能损伤评分，以及断头取脑组织做指标检测。

2.2 神经功能缺损程度评分 参照Berderson[8]评分标准评定大鼠神经功能缺损程度，评分在1～3分者为造模成功大鼠，纳入实验，0分和4分者弃去不用。具体评分标准，见表1。

表1 大鼠神经缺损程度评分Tab.1 The standard of neurofunctional scores of rats with cerebral ischemia/reperfusion injury

2.3 TTC染色以及梗死范围检测 大鼠麻醉后，生理盐水进行心脏灌流，开颅取脑,去除嗅球、小脑和低位脑干，于-20℃冰箱冷藏10 min，于冰盒中迅速沿冠状面切成2 mm厚切片，放入1%TTC染色剂中避光37℃孵育15 min，4%甲醛溶液固定1 h，样本拍照，采用Image-Pro Plus图片分析软件，测定脑梗死缺血面积和全脑面积，计算梗死体积比＝（∑梗死面积×厚度）/（∑全脑片面积×厚度）。

2.4 大鼠脑组织蛋白定量、SOD、MDA测定 大鼠开颅取脑,分离左右脑并分别称其质量，于冰盒中将左脑用生理盐水（按脑湿质量∶生理盐水=1∶3比例）匀浆，再将脑匀浆稀释至5%，根据BCA法测定样品中蛋白含量，严格按试剂盒说明书测定样品SOD活力、MDA含量。

2.5 统计学分析 采用SPSS 18．0统计软件分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较时，若方差齐采用LSD法，若方差不齐采用Dunnet T3法，P＜0．05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠神经功能缺损评分的比较 假手术组无神经功能缺损，I/R组大鼠具有明显的神经功能缺损，评分为（2．50±0．53）分。与I/R组比较，采用TMP、TCE以及TMP-TCE组预处理7 d后，显著改善大鼠神经功能缺损程度（P＜0．05）。见表2。

表2 缺血再灌注24 h后各组大鼠神经功能缺损评分（±s）Tab.2 The neurofunctional scores of rats 24 h after cerebral ischemia/reperfusion（±s） 分

表2 缺血再灌注24 h后各组大鼠神经功能缺损评分（±s）Tab.2 The neurofunctional scores of rats 24 h after cerebral ischemia/reperfusion（±s） 分

注：与I/R组比较，＃P＜0．05。

组别Sham组I/R组Nimodipine组TMP组TCE组TMP-TCE组n 10 10 10 10 10 10行为学得分0 2．50±0．53 1．57±0．84#1．77±0．82#1．71±0．76#1．74±0．67#

3.2 各组大鼠脑梗死范围的变化 TTC染色结果显示缺血再灌注24 h后，I/R组大鼠脑组织损伤严重，脑梗死体积显著增大（P＜0．01）。TMP、TCE组虽然能够减小模型大鼠的脑梗死体积，但与I/R组差异无显著性。而TMP-TCE组与I/R组相比，大鼠脑梗死体积显著缩小（P＜0．05）。见表3。

表3 缺血再灌注24 h后各组大鼠脑组织梗死体积比的变化（±s）Tab.3 Infarct volume of brains in rats after cerebral ischemia/reperfusion for 24 h（±s）%

表3 缺血再灌注24 h后各组大鼠脑组织梗死体积比的变化（±s）Tab.3 Infarct volume of brains in rats after cerebral ischemia/reperfusion for 24 h（±s）%

注：与Sham组比较，**P＜0．01；与I/R组比较，#P＜0．05。

组别Sham组I/R组Nimodipine组TMP组TCE组TMP-TCE组n 3 3 3 3 3 3梗死体积比0 30．26±3．44** 15．30±2．10#24．50±4．85 19．87±4．13 17．52±1．93#

3.3 各组大鼠脑组织SOD活性的变化 在氧化应激反应中，SOD具有抗氧化作用，并且能够对抗氧自由基所导致的神经细胞凋亡。脑缺血2 h再灌注22 h后，I/R组大鼠脑组织中SOD活力与假手术组相比显著降低（P＜0．05）。应用TMP、TCE和TMPTCE预处理7 d后，能明显升高脑缺血/再灌注大鼠脑组织SOD活力（P＜0．01，P＜0．05和P＜0．01）。TMPTCE配伍应用使得模型大鼠脑组织中SOD活力均高于TMP组和TCE组。见表4。

表4 缺血再灌注24 h后各组大鼠脑组织SOD活力改变（±s）Tab.4 SOD activities of brain tissue in rats 24 h after cerebral ischemia/reperfusion（±s）U/mg．prot

表4 缺血再灌注24 h后各组大鼠脑组织SOD活力改变（±s）Tab.4 SOD activities of brain tissue in rats 24 h after cerebral ischemia/reperfusion（±s）U/mg．prot

注：与Sham组比较，**P＜0．01；与I/R组比较，#P＜0．05，##P＜0．01。

组别Sham组I/R组Nimodipine组TMP组TCE组TMP-TCE组n 6 5 6 5 6 5 SOD 429．66±30．69 328．97±38．01** 420．99±61．35##444．56±77．79##405．07±34．22#461．68±42．96##

3.4 各组大鼠脑组织MDA含量的变化 自由基攻击细胞中不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化反应，从而导致组织损伤。MDA被认为是脂质过氧化反应的生物标志物。与假手术组相比，I/R组大鼠脑内MDA含量显著升高（P＜0．01）。与I/R组比较,TMP、TCE以及TMP–TCE能够显著降低模型大鼠脑内MDA含量（P＜0．01），降低幅度分别为59．85%、48．30%和65．75%。见表5。

表5 缺血再灌注24 h后各组大鼠脑组织MDA含量改变（±s）Tab.5 MDA content of brain tissue in rats 24 h after cerebral ischemia/reperfusion（±s）nmol/mg．prot

表5 缺血再灌注24 h后各组大鼠脑组织MDA含量改变（±s）Tab.5 MDA content of brain tissue in rats 24 h after cerebral ischemia/reperfusion（±s）nmol/mg．prot

注：与Sham组比较，**P＜0．01；与I/R组比较，##P＜0．01。

组别Sham组I/R组Nimodipine组TMP组TCE组TMP-TCE组n 6 6 6 6 4 6 MDA 27．39±4．72 49．11±7．15** 31．96±8．90##36．11±1．15##38．62±4．40##34．83±10．24##

4 讨论

脑缺血/再灌注损伤是多种机制参与的复杂病理生理过程。自由基、炎症反应、细胞内钙离子（Ca2+）超载、兴奋性氨基酸毒性作用等因素相互影响，调控脑缺血/再灌注损伤的发病进程[9]。当脑缺血缺氧时，脑内自由基迅速大量产生，超过体内的抗氧化系统清除能力，使得细胞蛋白质、脂质以及核酸过氧化，破坏细胞膜结构，导致细胞损伤及坏死。并且，大量产生的自由基通过多种途径细胞内凋亡信号通路，导致神经细胞凋亡。SOD是体内一种重要的氧自由基清除剂。MDA是自由基所引发的脂质过氧化反应的代谢产物。MDA水平的升高间接地反映生物膜受到自由基的损伤程度。本实验中，在大鼠脑缺血2 h，再灌注22 h后神经功能受到明显损伤，脑组织中SOD水平显著减低，MDA含量显著升高。因此，SOD活力和MDA含量的变化可间接反映自由基在体内的生成和体内抗氧化防御系统的功能状况，与缺血性中风的严重程度和预后恢复密切相关[10-11]。

中医认为缺血性脑卒中为本虚标实、上盛下虚之证，发病机理与风、火、痰、气、血密切相关，产生气滞血瘀，毒损脑络，神机失用。本病治则主要以活血化瘀，调理气血为主。白芷具有较高的的药用价值，与川芎常配伍应用。川芎既能活血又可行气，为“血中气药”，善治血瘀气滞病证。《本草经集注》记载“白芷为之使”。抗血栓形成是缺血性脑卒中预防和治疗的有效措施。笔者近期研究发现TMP能够延长正常小鼠凝血时间且具有剂量依赖关系，表明TMP具有活血化瘀和抗血栓形成作用。其机制可能与TMP扩张血管、抑制血小板聚集和改善微循环相关[12]。70 mg/kg TCE在小鼠体内虽然未体现明显的抗凝血作用，但是能够显著增强TMP的抗凝血活性（待发表）。因此，TCE协同增强TMP抗凝血活性，是两者伍用缓解脑缺血/再灌注损伤，改善缺血性脑卒中预后的机制之一。

体外和体内实验表明白芷具有抗炎和抗氧化作用，并且显示出神经保护效应[13]。其中，白芷香豆素类在体外具有确切的抗氧自由基和抗氧化作用[14]。给予大鼠50 mg/kg TCE预处理7 d后制备脑缺血/再灌注损伤模型。研究发现，TCE能够降低脑缺血/再灌注模型大鼠脑梗死体积，明显改善模型大鼠神经功能的损伤程度。对其机制研究发现，TCE通过降低组织中MDA含量以及提高SOD活力，发挥清除氧自由基和抗脂质过氧化作用，从而达到对脑缺血的神经保护效应。TMP具有神经保护作用，降低脑缺血/再灌注大鼠的梗死体积，增加脑组织内SOD水平，降低MDA含量，改善模型大鼠的神经损伤，能减轻脑缺血/再灌注损伤程度，与报道一致[5]。TMP与TCE配伍应用后，能明显缩小梗死体积，增强机体清除自由基的能力，减轻自由基所引发的氧化性损伤，优于两者的单独使用。

综上所述，本实验研究发现白芷总香豆素通过清除自由基，减轻过氧化反应，改善脑缺血/再灌注损伤，为缺血性脑卒中的治疗提供新的治疗方法。白芷总香豆素与川芎嗪伍用一方面通过减轻自由基的氧化应激损伤；另一方面通过抗血栓形成，改善血流动力学，发挥神经保护作用。为白芷与川芎临床配伍用药提供理论依据。在此基础上，将对白芷总香豆素以及与川芎嗪配伍应用的神经保护的作用机制进行深入系统的研究。

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Effect of coumarins extract of Angelica dahurica,tetramethylpyrazine and compatible application on cerebral isxhemia/ reperfusion injury in rats

ZHONG Pei-ru,ZHANG Fang-liang,HE Li-na,LIU Sha-sha,Fan Yao-wen,HE Xin
（College of Chinese Materia Medica，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China）

[Objective]To investigate the individual and compatible effects of coumarins extracts of Angelica dahurica and tetramethylpyrazine(TMP)on cerebral ischemia/reperfusion(I/R)injury in rats．[Methods]Male healthy SD rats were randomly divided into six groups:sham group,I/R group,TMP group (7．5 mg/kg tetramethylpyrazine),TCE group (50 mg/kg total coumarins extract of Angelica dahurica),TMP-TCE group(7．5 mg/kg+50 mg/kg)and Nimodipine group(10 mg/kg)．Rats were pretreated with test drugs for sequential seven days by intragastric administration and underwent focal cerebral ishchemia for 2 h and reperfusion for 22 h．The neurofunctional scores were evaluated and the infarct volume was measured by triphenyltetrazolium chloride (TTC)staining．The activity of superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA)content in brain were determined to investigate the mechanism．[Results]Compared with I/R group,the neurological deficit in TMP,TCE and TMP-TCE group was significantly improved(P＜0．05),meanwhile the cerebral infarct volume of TMP-TCE group was reduced significantly(P＜0．05)．The activity of SOD was enhanced(P＜0．05 or P＜0．01),and the content of MDA was decreased (P＜0．01)．[Conclusion]Individual and compatible application of the total coumarins extract of Angelica dahurica and tetramethylpyrazine have a protective effect against the ischemic stroke,which might be related with inhibiting the lipid peroxidation of the brain tissue．

total coumarins extract of Angelica dahurica;tetramethylpyrazine;cerebral ischemia/reperfusion;lipid peroxidation; superoxide dismutase;malondialdehyde

R285．5

A

1672-1519（2014）09-0560-04

2014-04-02）

（本文编辑：高 杉，张震之）

10．11656/j．issn．1672-1519．2014．09．15

教育部高等学校博士学科点专项科研基金资助项目（20121210110011）；国家自然科学基金资助项目（81373890）。

钟佩茹（1976-），女，博士，讲师，主要从事中药药理学研究。

何 新，E-mail:hexintn@163．com。