HPLC法测定金黄膏中小檗碱和巴马丁的含量*

刘俊红，王 红，李棣华，曲鹏飞，吕沅姗

（1．天津市中西医结合急腹症研究所，天津 300100；2．天津市中医药大学第二附属医院，天津 300150）

HPLC法测定金黄膏中小檗碱和巴马丁的含量*

刘俊红1，王 红2，李棣华1，曲鹏飞2，吕沅姗1

（1．天津市中西医结合急腹症研究所，天津 300100；2．天津市中医药大学第二附属医院，天津 300150）

摘要：[目的]建立同时测定金黄膏中盐酸小檗碱、巴马丁含量的方法。[方法]采用高效液相色谱法，色谱柱为Apollo C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸（二元梯度洗脱），检测波长为346 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为30℃。[结果]盐酸小檗碱和巴马丁的进样量分别在0.007 25～0.145 μg，0.005 5～0.110 μg范围内与各自峰面积积分值呈良好的线性关系，平均加样回收率分别为98.8%和100.9%。[结论]该方法操作简便、重现性好，适用于金黄膏中巴马丁和盐酸小檗碱的含量测定。

关键词：金黄膏；盐酸小檗碱；巴马丁；高效液相色谱法

如意金黄散出自明代陈实功编著的《外科正宗》[1]，由大黄、黄柏、姜黄、白芷、天花粉、天南星等组成，为2010年版《中国药典》（一部）收录的品种，临床用于治疗疮疡肿痛、丹毒流注、跌打损伤等证[2]。基于临床适用症的需要，已有多种其外用剂型如巴布剂[3]、乳膏剂[4]、贴剂[5]见于文献报道。金黄膏作为本院制剂已使用多年，临床疗效确切。《中国药典》上规定了如意金黄散中姜黄素的含量测定，也有用高效液相色谱（HPLC）测定散剂或贴膏剂中大黄5种成分、小檗碱或姜黄素的含量[6-8]。因为黄柏为君药之一，本研究制定了金黄膏中黄柏有效成分小檗碱和巴马丁的含量测定方法，为其质量控制提供依据。

1 实验材料

仪器：SSI PC2000型高效液相色谱仪(美国科学系统公司)，EZChrom Elite Client/Server色谱工作站，AL104电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）。

药品与试剂：如意金黄膏（天津市中医药大学第二附属医院制剂室提供），盐酸小檗碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110713-200911)，巴马丁对照品（含量≥98%，天津科曼斯特医药科技发展有限公司）。甲醇、乙腈为色谱纯（天津市康科德科技有限公司），磷酸为分析纯。

2 实验方法和结果

2.1 色谱条件 色谱柱：ApolloC18（4.6mm×250mm，5 μm），流动相：A相为乙腈，B相为0.1%磷酸水溶液，采用梯度洗脱程序，见表1，流速1.0 mL/min，检测波长346 nm，柱温：30℃，理论板数按盐酸小檗碱峰计算不低于20 000。

表1 梯度洗脱表Tab.1 Gradient elution table

2.2 方法学考察

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取盐酸小檗碱和巴马丁对照品，分别用乙腈配制成浓度为0.290 mg/min和0.221 mg/min的溶液，作为储备液。再分别吸取储备液50、100、250、500、800、1 000 μL，加入10 mL容量瓶，加乙腈稀释定容至刻度，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.2.2 线性关系实验 分别取上述对照品溶液各5μL注入液相色谱仪，按2.1项下色谱条件测定峰面积。色谱图见图1（B）。以各对照品进样量（X，μg）对峰面积（Y^，mAu）进行线性回归，回归方程及线性范围见表2。

表2 回归方程及线性范围Tab.2 Regression equation and linear range

2.2.3 供试液的制备 取药膏1.5g，精密称质量，加入三角瓶中，加石油醚（60~90℃）30mL超声处理5min，取出，静置，小心吸取上层溶液，再加入石油醚20mL，充分振摇洗涤，静置，再小心吸取上层溶液，残渣挥干溶剂。用25 mL的甲醇-0.1%磷酸水（1∶1）溶液分次转移至25 mL容量瓶中，超声处理30 min，取出，放冷，加入提取溶剂至刻度，过膜，即得。

2.2.4 精密度实验 取供试品溶液，连续进样5次，分别得出巴马丁和盐酸小檗碱的峰面积，计算相对标准偏差（RSD），盐酸小檗碱为2.04%，巴马丁为1.95%。表明仪器的精密度良好。

2.2.5 稳定性实验 取供试品溶液，于不同时间间隔进样测定，得到峰面积进行统计，盐酸小檗碱RSD 1.51%，巴马丁RSD 2.03%。表明两种成分在24 h内比较稳定。

2.2.6 重现性实验 按2.2.3项下制备供试品溶液的方法制备样品5份，分别测定并计算含量。结果巴马丁RSD 3.87%，盐酸小檗碱RSD 1.17%。表明两种成分含量测定方法的重现性较好。样品色谱图见图1（A）。

图1 HPLC-UV色谱图Fig．1 HPLC-UV chromatogram

2.2.7 专属性实验 除去黄柏，按处方比例称取金黄膏其余药味组成，制备金黄膏。参照2.2.3项下制备阴性供试液，同样品方法测定，色谱图见图1（C）。结果基本没有干扰。

2.2.8 加样回收率实验 精密称取1.5 g药膏6份，分别加入标准品巴马丁和小檗碱储备液各一定量，同上脱脂方法操作，然后用50 mL的甲醇-0.1%磷酸水（1∶1）溶液分次转移至50 mL容量瓶中，超声处理30 min，取出，放冷，加入提取溶剂至刻度，过膜，即得。进样20 μL。平均回收率巴马丁为98.8%，RSD 1.85%，盐酸小檗碱为100.9%，RSD 2.5%。

3 讨论

3.1 金黄膏基质为脂溶性，而且用量大 对提取溶剂进行筛选时，发现即使高浓度的乙醇或甲醇均不能将药膏打散使其均匀分散，因此先用乙醚或石油醚脱脂，不仅可以去除基质，同时还可以去除其他脂溶性成分。筛选石油醚用量时，分别用（30，30mL）、（30，20mL）和30mL超声处理，通过色谱分析，30mL脱脂的样品中指标峰不能达到基线，另两种方法对指标峰及其他峰的影响差异不大，因此选用30 mL脱脂，20 mL洗涤。

3.2 提取溶剂的筛选 据报道甲醇对小檗碱的溶解度优于乙醇[9]，分别筛选了甲醇或乙腈与0.1%磷酸水溶液的混合溶剂，以巴马丁和小檗碱的含量之和为标准，结果甲醇-0.1%磷酸水溶液（1∶1）≈乙腈-0.1%磷酸水溶液（1∶1）＞乙腈-0.1%磷酸水溶液（3∶1）＞乙腈-0.1%磷酸水（1∶3）溶液＞0.1%磷酸水溶液，选择甲醇-0.1%磷酸水溶液（1∶1）。

3.3 超声时间和溶剂用量的筛选 分别考察提取时间为30、40、50 min，溶剂体积为25 mL和50 mL。结果提取的巴马丁和小檗碱含量差异不明显，选择超声处理30 min，提取溶剂用量为25 mL即可。

3.4 检测波长的选择 盐酸小檗碱在波长346 nm与265 nm处有最大吸收，巴马丁也吸收较强，吸收程度差别不大。相对来说，波长346 nm处基线较直，其他峰对盐酸小檗碱和巴马丁的干扰小，比较稳定，因此选择346 nm。

3.5 流动相的选择 考察了几种流动相，如乙腈-0.02 mol/L磷酸二氢钾（5%磷酸调pH 3）[10]、乙腈-0.1 mol/L磷酸二氢钾溶液[11]、乙腈-0.1%磷酸水溶液中加入十二烷基磺酸钠，还有乙睛-0.1%磷酸水溶液[12]等度洗脱，结果发现，几种流动相对小檗碱的影响不大，峰形较好，但其前面的巴马丁和其他的峰形和分离度较差，而且十二烷基磺酸钠黏性较大，泡沫性强。最后考虑使用梯度洗脱，结果较满意。

本实验考察了黄柏中其他生物碱，其中保留时间（Rt）为5.0 min的是盐酸黄柏碱，Rt为8.6 min的是药根碱，由于含量更低，或有干扰，误差大，没有计算在内。

参考文献：

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（本文编辑：高 杉，于春泉）

中图分类号：R284.1

文献标识码：A

文章编号：1672-1519（2014）02-0110-03

收稿日期：（2013-09-20）

*基金项目：国家自然科学基金面上项目（81072818）。

作者简介：刘俊红（1968－），女，副研究员，研究方向为中药制剂工艺及质量标准研究。

通讯作者：王 红，E-mail:ctwanghong@sina.com。

Determination of berberine and palmatine in Jinhuang cream by HPLC

LIU Jun-hong1,WANG Hong2,LI Di-hua1,QU Peng-fei2,LV Yuan-shan1
（1.Tianjin Institute of Acute Abdomen by Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Tianjin 300100，China;2.The Second Affiliated Hospital of Tianjin University of TCM，Tianjin 300150，China）

Abstract:[Objective]To establish a method for simultaneous determination of berberine and palmatine in Jinhuang cream.[Methods] A HPLC method was performed on Apollo C18(250 mm×4.6 mm,5 μ)column.The mobile phase consisted of acetonitrile-0.1%phosphoric acid（gradient elution）with the detection wavelengh at 346 nm.The flow rate was 1.0 mL/min and the column temperature was at 30℃.

[Results]The content of berberine hydrochloride in the range of 0.007 25~0.145 μg and the content of palmatine in the range of 0.005 5~ 0.110 μg had good linear relationships with the area of eluted peak，and the recovery rate（the average recoveries）was 98.8%and 100.9% respectively.[Conclusion]This method is simple and repeatable,and is suitable for the content determination of berberine and palmatine in Jinhuang cream.

Key words：Jinhuang cream;berberine hydrochloride;palmatine;HPLC