荣筋片影响SAMP6鼠血清成骨-成脂分化调控因子的实验研究*

王 平，杨 光，吴纯标，王为民，赵雪圆，张君涛，张 超

（天津中医药大学第一附属医院骨伤科，天津 300193）

·实验研究·

荣筋片影响SAMP6鼠血清成骨-成脂分化调控因子的实验研究*

王 平，杨 光，吴纯标，王为民，赵雪圆，张君涛，张 超

（天津中医药大学第一附属医院骨伤科，天津 300193）

摘要：[目的]以SAMP6及SAMR1鼠为研究对象，观察荣筋片对骨形态发生蛋白（BMP-2）、过氧化酶活化增生受体-γ（PPAR-γ）和脂联素（ADP）血清含量的影响，探讨荣筋片防治骨质疏松症的作用机制。[方法]选取6月龄SAMP6鼠36只，雌雄各半，随机分为SAMP6空白对照组、荣筋片组、仙灵骨葆组。另取11只同月龄性SAMR1鼠，作为同源对，将荣筋片配制成溶液。空白对照组给予0.5 mL生理盐水灌胃，每日1次，连续12周后。摘眼球采血，ELISA法检测血清BMP-2、PPAR-γ和ADP的含量。[结果]空白对照组BMP-2血清含量明显低于SAMRl对照组、仙灵骨葆和荣筋片组（P＜0.01，P＜0.05），差异有显著性。SAMRl对照组相比BMP-2血清含量高于仙灵骨葆组和荣筋片组（P＜0.01，P＜0.05）。而荣筋片组高于仙灵骨葆组（P＜0.05）。空白对照组PPAR-γ血清含量明显高于SAMRl对照组（P＜0.01）。仙灵骨葆组、荣筋片组和空白对照组组间没有统计学差异（P＞0.05）。ADP血清含量空白对照组明显高于SAMRl对照组（P＜0.01）。仙灵骨葆组和荣筋片组明显低于空白对照组（P＜0.01），相比SAMRl对照组明显升高（P＜0.01）。[结论]荣筋片与仙灵骨葆能增加SAMP6鼠血清促成骨分化因子BMP-2含量，降低SAMP6鼠血清促成脂分化因子PPAR-γ、ADP含量。两种中药可能改善自发性骨质疏松动物骨髓基质干细胞成骨-成脂分化的异常。

关键词：荣筋片；骨质疏松症；骨髓基质干细胞；成骨-成脂分化

骨质疏松症（OP）是以骨量减少、骨的微观结构退化为特征的，致使骨的脆性增加以及易于发生骨折的一种全身性骨骼疾病[1]。近年研究表明衰老和病理因素造成的骨髓基质干细胞（BMCS）成骨-成脂分化异常，是骨质疏松的重要发病因素[2]。中医学“肾主骨生髓”理论与骨髓间充质干细胞（MSCs）增殖分化的相关性，为中医学肾本质及补肾中药研究提供了新思路[3]。笔者在前期研究的基础上，利用快速骨老化小鼠（SAMP6）这一增龄性骨质疏松动物模型，观察补肾健脾中药复方荣筋片对其血清成骨-成脂关键调控因子的影响，进行了本研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验药物与试剂 荣筋片：甘草、牛膝、白蒺藜、陈皮、杜仲、茯苓等。天津中医药大学第一附属医院院内制剂，批准文号：津药制字（2001）Z第0195号，由天津中医药大学第一附属医院药厂提供。仙灵骨葆胶囊：淫羊藿、续断、补骨脂等。由贵州同济堂制药公司提供，批准文号：国药准字Z20025337。TRIZOL试剂（invitrogen），淋巴细胞分离液（北京索莱宝），氯仿（BBI），异丙醇（BBI），无水乙醇（BBI），DEPC H2O（BBI），BMP-2试剂盒（博士德），PPARγ2试剂盒（SantaCruz），ADP试剂盒（SantaCruz）。

1.1.2 主要仪器 电子天平（瑞士METTER AE100型），移液器（德国EPPENDORF），干燥箱（日本三洋MIR-153型），低温冰箱（日本三洋MDF-382E型），恒温水浴箱（江苏太仓医用仪器厂DSHZ-300型），超低温冰箱（Model 925,Forma Scientific Inc，美国），台式冷冻离心机（Universal 16R,Hettich Zentrifugen，德国）。

1.1.3 实验动物与分组 选取健康龄6月龄SAMP6鼠36只,雌雄各半，按随机分为荣筋片组、仙灵骨葆组、空白对照组，另取11只同月龄抗快速老化小鼠（SAMR1），作为同源对照组。所取动物均由天津中医药大学第一附属医院实验动物中心提供，所有实验动物都饲养在恒温（24±2）℃、湿度（55±5）%，12 h/ 12 h循环光照的条件下，自由进食饮水，每笼5只小鼠，每周更换鼠笼1次，以排除饮食及环境等所有可能对实验结果产生影响的因素。

1.2 方法

1.2.1 灌胃方案 据文献[4]，人与小鼠用药剂量的折算系数W＝9.01，按（g/kg）＝W×人常用量（g/kg）计算出小鼠的用药剂量。将荣筋片按换算剂量配制成溶液，每次给药0.5 mL，给药前将小鼠禁食6 h，使其处于空腹状态，便于药物的吸收。空白对照组给予0.5 mL生理盐水灌胃，每日1次，连续12周。

1.2.2 血清的制备 在末次灌胃1 h后固定小鼠，摘眼球采血，不加抗凝剂。室温下静置2 h后待血块自然凝固收缩后，1 500 r/min离心15 min，分离上层血清，-20℃条件下保存备用。采用酶联免疫吸附实验（ELISA）测定血清中成骨-成脂分化关键调控因子骨形态发生蛋白（BMP-2）、过氧化酶活化增生受体-γ（PPAR-γ）和脂联素（ADP）的含量。

1.2.3 统计学方法 数据采用SPSS 18.0软件处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析用（one-wayANOVA），P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清BMP-2结果的比较 各组血清BMP-2的含量见表1，空白对照组BMP-2血清含量明显低于SAMRl对照组、仙灵骨葆组和荣筋片组（P＜0.01，P＜0.05），有显著差异。SAMRl对照组相比BMP-2血清含量高于仙灵骨葆组和荣筋片组（P＜0.01，P＜0.05），而荣筋片组高于仙灵骨葆组（P＜0.05）。

表1 各组血清BMP-2含量（x±s）Tab.1 The BMP-2 contents of serum in each group（x±s）pg/mL

2.2 各组血清PPAR-γ结果的比较 各组血清PPAR-γ的含量见表2，空白对照组PPAR-γ血清含量明显高于SAMRl对照组（P＜0.01）。仙灵骨葆组、荣筋片组和空白对照组组间没有明显差异（P＞0.05）。

2.3 各组血清ADP的结果比较 各组血清ADP的含量见表3，空白对照组ADP血清含量明显高于SAMRl对照组（P＜0.01），有显著差异。仙灵骨葆组和荣筋片组ADP血清含量明显低于空白对照组（P＜0.01），相比SAMRl对照组明显升高（P＜0.01），有显著差异。荣筋片组和仙灵骨葆组组间没有统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组血清PPAR-γ含量（x±s）Tab.2 The PPAR-γ contents of serum in each group（x±s）ng/mL

表3 各组ADP血清含量（x±s）Tab.3 The ADP contents of serum in each group（x±s）pg/mL

3 讨论

OP隶属于中医学“骨痿”范畴[5-6]，中医学认为肾藏精，主骨生髓，肾精足则筋骨强健有力，荣筋片为津门已故名老中医叶希贤创立，临床用于治疗OP有较好的效果，具有补益肝肾、强筋壮骨，健脾益气之功效。骨组织脂肪细胞、成骨细胞均来源于BMCS，成骨与成脂分化为“倒数”关系[7]，BMCS分化方向改变可能是OP的原因之一。SAMP6鼠较好地体现了增龄性OP的病理变化，是研究OP发病机理及开发有效治疗手段的理想模型[8-9]，伴随骨质疏松的发生，SAMP6鼠BMCS成脂分化明显增强，成骨分化减弱[10-11]。

BMP-2是骨组织形成过程中最关键的调节因子[12]。本实验研究发现，各组SAMP6鼠BMP-2血清含量均低于SAMRl鼠，说明SAMP6鼠的BMCS成骨分化能力减弱，可能与其自发性骨质疏松有关，而荣筋片组BMP-2血清含量明显高于空白对照组，说明荣筋片能够促进SAMP6鼠BMCS成骨方向分化。PPAR-γ介导MSCs成脂分化可直接影响成骨细胞的分化，在某种程度上在MSCs成骨与成脂的分化进程中可能起到“分子开关”的作用[13]。本研究发现SAMP6鼠的PPAR-γ血清含量明显高于SAMRl鼠，说明SAMP6鼠BMCS成脂分化增强，与相关研究结果一致[10-11]，而荣筋片、仙灵骨葆对PPAR-γ血清含量未显示出明显影响。另一种重要的成脂分化因子ADP，参与糖、脂代谢[14]，可同时影响骨形成和骨吸收[15]，本研究中SAMP6鼠的ADP血清含量明显高于SAMRl小鼠，亦说明SAMP6鼠BMCS成脂分化增强，而荣筋片组明显低于空白对照组，说明荣筋片某种程度上能够抑制BMCS向成脂细胞分化。

MSCs成骨-成脂分化的方向主要是由骨髓局部微环境多种因素决定，荣筋片和仙灵骨葆胶囊两种中药均可增加SAMP6鼠血清促成骨分化因子BMP-2含量，降低SAMP6鼠血清促成脂分化因子PPAR-γ、ADP含量，推测二者均能改善自发性骨质疏松动物BMCS成骨-成脂分化的异常，而骨髓局部微环境成骨-成脂分化的影响及其作用机制还有待于进一步实验研究。

参考文献：

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（本文编辑：马 英，高 杉）

中图分类号：R285.5

文献标识码：A

文章编号：1672-1519（2014）02-0088-03

收稿日期：（2012-12-30）

*基金项目：国家自然科学基金资助项目（30801475）。

作者简介：王 平（1964-），男，医学博士，主任医师，教授，硕士研究生导师，主要从事慢性脊柱退变疾病及疼痛症的中西医诊治研究。

通讯作者：杨 光，E-mail:yanyangsky@163.com。

The effection on adipogenesis-osteogenesis differentiation factors of SAMP6 mice serum by Rong Jinpian

WANG Ping,YANG Guang,WU Chun-biao,WANG Wei-min,ZHAO Xue-yuan,ZHANG Jun-tao,ZHANG Chao
（Department of orthopedics and traumatology,the First Afflilated Hospital of Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China）

Abstract:[Objective]Use senescence-accelerated mouse prone 6(SAMP6)mice and senescence accelerated mouse re-istant1(SAMR1) mice as the research object,observe the effection of Rong Jinpian on BMP-2,PPAR-γ and ADP in serum.[Methods]Choose 36 six months SAMP6 mices,male and female half,according to randomized SAMP6 blank control group,Rong jinpian group,Xianling Gubao group.Another 11 months with resistance to rapid aging SAMR1 mice,as homologous comparison control group,the Rong Jinpian mixture solution according to the dose conversion.Blank control group to give 0.5 mL saline lavage,1 times a day,12 consecutive weeks.ELISA method to detect serum BMP-2,PPAR-γ and ADP levels was used.[Results]Serum BMP-2 of blank control group was significantly lower than the other three groups(P＜0.01,P＜0.05).The SAMRl group was higher than the Xianling Gubao and Rong Jinpian group(P＜0.01, P＜0.05).Serum PPAR-γ level of blank control group was significantly higher than the other three groups(P＜0.01,P＜0.05).Compared with that blank control group,Rong Jinpian and Xianling Gubao group on ADP significantly lower.[Conclusion]Compared with SAMP1 group,SAMP6 mice had lower BMP-2 level,higher PPAR-γ and ADP level in serum because spontaneous osteoporosis.Rong Jinpian and Xianling Gubao could raise BMP-2 level,dcrease PPAR-γ and ADP level in serum of SAMP6 mice.

Key words:Rong Jinpian;osteoporosis;marrow stromal cell;differentiation of adipogenesis and osteogenesis