茯苓多糖对B16黑色素瘤人工肺转移模型的影响*

张密霞，张德生，庄朋伟，张艳军

（天津中医药大学，天津 300193）

茯苓多糖对B16黑色素瘤人工肺转移模型的影响*

张密霞，张德生，庄朋伟，张艳军

（天津中医药大学，天津 300193）

摘要：[目的]探讨茯苓多糖对B16黑色素瘤小鼠人工肺转移的影响，并对其作用机制进行初步研究。[方法] C57BL/6小鼠接种B16黑色素瘤，分为茯苓多糖高、低剂量组、顺铂组、模型组，茯苓多糖高、低剂量组分别给予每只小鼠茯苓多糖0.5 mg、0.33 mg，顺铂组给予顺铂0.04 mg，模型组给予生理盐水，接种瘤细胞后第2天开始尾静脉注射给药，隔天给药1次。观察小鼠一般状态，造模后21 d取肺，计数肺表面转移灶个数、HE染色检测肺微小转移灶个数，并检测外周血白细胞数量及脾质量、脾指数。[结果]顺铂能够抑制肺转移，同时降低小鼠体质量、外周血白细胞数量、脾质量和脾指数。而茯苓多糖高、低剂量组对B16荷瘤鼠的体质量无明显影响，茯苓多糖高剂量可明显降低肺表面转移灶个数，茯苓多糖高、低剂量可减少肺微小转移灶个数，高剂量组外周血白细胞数量明显降低，低剂量组与模型组无统计学差异，低剂量可增加B16荷瘤鼠的脾质量和脾指数，高剂量对B16荷瘤鼠的脾质量和脾指数无明显影响。茯苓多糖高、低剂量组脾质量和脾指数均高于顺铂组。[结论]茯苓多糖能够抑制尾静脉注射B16荷瘤小鼠肺转移，增加其脾质量和脾指数，无明显增加其外周血白细胞数量的作用，推测活化外周血白细胞，增强免疫功能可能参与茯苓多糖抑制肿瘤转移的机制。

关键词：茯苓多糖；B16黑色素瘤小鼠；肺转移；白细胞

恶性肿瘤是一类严重危害人类身体健康的疾病，肿瘤的侵袭、转移是肿瘤复发以及导致患者死亡的重要原因，约90%的肿瘤患者死于肿瘤转移，50%以上恶性肿瘤患者于初次诊断时已发现有转移[1]。因此防治肿瘤的侵袭、转移是降低肿瘤患者病死率的重要途径之一。肿瘤常见的转移途径有3种：1）淋巴道转移，2）血道转移，3）种植转移。

近年来有研究表明，固有免疫系统在肿瘤发生和发展过程中扮演相当重要的角色。崔正等[2-4]报道，肿瘤自然消退/完全消退（SR/CR）小鼠的粒细胞能够抵抗多种类型的癌细胞，可使肿瘤产生自发性消退，其中性粒细胞体外能在肿瘤细胞周围形成玫瑰花环样结构，通过“发现肿瘤细胞→识别瘤细胞表面特征并包围瘤细胞→释放抗瘤物质”杀死瘤细胞。移植SR/CR小鼠粒细胞至普通小鼠，普通小鼠可获得抗肿瘤能力。如果在肿瘤转移过程中，中性粒细胞能在肿瘤细胞周围形成玫瑰花环样结构，并杀死瘤细胞，则可能抑制肿瘤转移。

现代药理学研究表明茯苓具有多种生物活性，如抗氧化、抗肿瘤、抗细胞黏附与转移及机体免疫调节的作用。在前期实验中笔者发现，茯苓多糖能够促进体外培养的大鼠中性粒细胞在肝癌细胞周围形成玫瑰化环样结构，并且与增加白细胞CD11b和CD18mRNA表达相关。

因此本实验拟通过考察茯苓多糖对B16黑色素瘤人工肺转移的影响，并检测外周血白细胞数量及脾质量、脾指数，以期明确茯苓多糖是否具有抗肿瘤生长和转移的作用并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 茯苓多糖提取物粉末：由天津中医药大学赵骏老师提供。顺铂注射液：云南生物谷灯盏花药业有限公司。

C57BL/6荷B16黑色素瘤小鼠40只，4周龄，雌雄各半，尾静脉注射接种黑色素瘤细胞2×105个/只，购自北京力科爱达生物技术咨询服务中心。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组和给药方法 将40只已接种B16黑色素瘤的小鼠采用随机数字表法随机分为4组，每组10只，即模型组、顺铂注射液组、茯苓多糖低剂量组、茯苓多糖高剂量组。

接种瘤细胞后第2天开始尾静脉注射给药，茯苓多糖高剂量组给予每只小鼠茯苓多糖0.5 mg，茯苓多糖低剂量组给予每只小鼠茯苓多糖苓多糖0.33 mg，顺铂组给予顺铂0.04 mg，模型组给予生理盐水，所有药物均于给药当天用生理盐水新鲜配制，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，每只0.2 mL，隔天给药1次。

1.2.2 一般情况观察 定期观察动物精神状态、进食和排便情况。

1.2.3 对小鼠体质量的影响 第1次给药前电子天平称量小鼠体质量，此后隔天称质量，并绘制体质量变化曲线。

1.2.4 外周血白细胞数量 接种肿瘤后第21天，小鼠称质量，眼内眦取血，加入白细胞稀释液计数白细胞数量。

1.2.5 肺转移灶个数及肺转移抑制率 接种肿瘤后第21天，取血后处死小鼠，取出肺脏，经生理盐水漂洗后计数小鼠肺表面转移灶个数。转移灶计算方法：转移灶呈黑色小结节状。据肺结节直径将其分为4级：Ⅰ级＜0.5 mm，0.5 mm≤Ⅱ级≤l mm，1 mm≤Ⅲ级≤2 mm，Ⅳ级≥2 mm[5]，肺表面转移结节总数＝Ⅰ级转移灶个数×1+Ⅱ级转移灶个数×2+Ⅲ级转移灶个数×3+Ⅳ级转移灶个数×4。计数完毕后将肺组织放入4%多聚甲醛固定，以备后续实验使用。

肺转移抑制率（%）＝（模型组平均肺表面转移结节数-治疗组平均肺表面转移结节数）/模型组平均肺转移结节数×100%。

1.2.6 脾质量及脾指数 接种肿瘤后第21天，取血后处死小鼠，取出脾脏，称取脾质量，并计算脾指数。计算公式：脾指数＝脾质量/（体质量-瘤质量）× 100%。

1.2.7 病理组织学检测 将小鼠肺组织放入4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、切片，苏木-伊红染色，每个样本随机选取5个视野，10×物镜下计数微小转移灶个数。

1.3 统计学方法 应用SPSS 18.5统计软件进行分析。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示。正态分布计量资料的组间比较采用单因素方差分析（oneway ANOVA），偏态分布计量资料的组间比较采用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 一般状态观察 B16黑色素瘤人工肺癌转移模型小鼠给药后，顺铂组小鼠表现自主活动减少、倦怠，茯苓多糖高、低剂量组小鼠精神状态良好，毛色光滑，未见明显异常。

2.2 茯苓多糖对B16黑色素瘤荷瘤小鼠体质量的影响 由图1可以看出，与模型组比较，茯苓多糖高、低剂量组对B16荷瘤鼠的体质量无明显影响，顺铂组小鼠体质量明显减轻。

图1 茯苓多糖对B16黑色素瘤荷瘤鼠体质量变化的影响Fig.1 The body weight of mice after melanoma B16 cells injection

2.3 茯苓多糖对B16黑色素瘤人工肺转移模型肺表面转移灶个数的影响 各组小鼠均出现肺转移，顺铂、茯苓多糖高剂量可明显降低肺表面转移灶个数，茯苓多糖低剂量组肺表面转移灶个数与模型组无统计学差异，顺铂组、茯苓多糖高剂量和低剂量组对肺转移的抑制率分别为45.8%、38.8%、23.4%。顺铂组和茯苓多糖高剂量组小鼠肺表面转移灶个数与模型组有统计学差异（P＜0.05）。见表1。

表1 茯苓多糖对B16黑色素瘤人工肺转移模型肺表面转移灶个数的影响Tab.1 Effects of pachymaran on lung metastasis in B16 melanoma mice

2.4 茯苓多糖对B16黑色素瘤人工肺转移模型肺微小转移灶的影响 HE染色观察计数微小转移灶个数，结果表明，用药各组与模型组比较均可以显著减少B16黑色素瘤荷瘤鼠肺部微小转移灶的数量（P＜0.05），与顺铂组比较，茯苓多糖高剂量组无统计学差异。见表2。

2.5 茯苓多糖对B16黑色素瘤人工肺癌转移模型小鼠外周血白细胞数的影响 与模型组比较，茯苓多糖高剂量组与顺铂组外周血白细胞数量明显降低，茯苓多糖低剂量组与模型组无统计学差异。与顺铂组比较，茯苓多糖低剂量和高剂量组外周血白细胞数量均明显增加（P＜0.05）。见表3。

表2 茯苓多糖对B16黑色素瘤人工肺转移模型小鼠肺微小转移灶的影响（x±s）Tab.2 Effects of pachymaran on lung micrometastases in B16 melanoma mice（x±s） 个

表3 茯苓多糖对B16黑色素瘤荷瘤鼠外周血白细胞数的影响（x±s）Tab.3 Effects of pachymaran on the count of the peripheral blood leukocyte in B16 melanoma mice（x±s）

2.6 茯苓多糖对B16黑色素瘤人工肺癌转移模型小鼠脾质量和脾指数的影响 与模型组比较，顺铂组明显降低B16荷瘤鼠脾质量和脾指数，茯苓多糖低剂量组可以增加B16荷瘤鼠的脾质量和脾指数（P＜0.05），茯苓多糖高剂量对B16荷瘤鼠的脾质量和脾指数无明显影响，茯苓多糖高、低剂量组脾指数无统计学差异。与顺铂组比较，茯苓多糖高、低剂量组均能增加B16荷瘤鼠的脾质量和脾指数（P＜0.05）。见表4。

表4 茯苓多糖对B16黑色素瘤荷瘤鼠脾脏指数的影响（x±s）Tab.4 Effects of pachymaran on spleen index in B16 melanoma mice（x±s）

3 讨论

B16黑色素瘤是1954年发现的，该瘤是自发于纯系鼠C57BL/6耳根皮肤的色素瘤，B16黑色索瘤的肺转移率大于90%。尾部静脉注射会迫使肿瘤细胞集中于肺部毛细血管，可以用来研究肿瘤细胞肺部溢出和定居功能[6]，Hart[7]给C57BL/6小鼠从尾静脉注入B16黑色素瘤细胞后3周杀鼠检查转移灶，同时用同位素标记肿瘤细胞，并定时测各器官放射强度，发现肿瘤细胞只定位于肺。

肿瘤的侵袭及血行转移是一个复杂、多步骤的过程，大致过程为原发肿瘤细胞自律性增殖后，从原发肿瘤灶脱离，降解基底膜，向外浸润、迁移进而进入循环系统随着血流到达并停留于远处的血管壁穿过血管，侵入细胞外基质，最后在特定的组织或器官形成转移灶。

顺铂是临床上常用的化疗药物之一，进入肿瘤细胞后与DNA交叉联合抑制其复制，并损伤细胞膜结构，有较强的广谱抗肿瘤作用，其疗效确切，但不良反应大。贾英杰等[8]单纯应用中药治疗中晚期恶性肿瘤患者，能够提高患者卡氏评分、改善患者临床症状、总体功能，显著提高患者的生活质量。临床常用中草药经现代药理及临床研究发现，党参、黄芪、白术、山药、茯苓等益气健脾药物具有调节肿瘤患者免疫功能的作用，以增强免疫监视能力为特征，能提高T淋巴细胞功能，提高自然杀伤细胞细胞的活性，从而可提高机体识别异己、杀灭变异、抑制肿瘤的能力[9]。茯苓多糖是茯苓的主要成分，硫酸化茯苓多糖可以通过增强NK细胞杀伤活力、促进淋巴细胞增殖、增强机体特异性免疫功能而发挥抗肿瘤作用，还可以拮抗免疫抑制药所致的免疫抑制[10]。

本实验采用尾静脉注射B16黑色素瘤复制人工肺转移模型，以顺铂作对照，检测茯苓多糖对荷瘤小鼠肺转移、外周血白细胞数量及脾质量、脾指数的影响，以期明确茯苓多糖是否具有抗肿瘤生长和转移的作用并探讨其作用机制。

实验结果表明，顺铂虽然能够抑制肺转移，但同时有降低小鼠体质量、外周血白细胞数量及脾质量和脾指数等不良反应。而茯苓多糖高、低剂量组对B16荷瘤鼠的体质量无明显影响，茯苓多糖高剂量可明显降低肺表面转移灶个数及肺微小转移灶个数，茯苓多糖低剂量可减少肺微小转移灶个数，说明茯苓多糖高剂量组外周血白细胞数量明显降低，茯苓多糖低剂量组外周血白细胞数量与模型组能够抑制肺转移。茯苓多糖高剂量组外周血白细胞数量明显降低，茯苓多糖低剂量组外周血白细胞数量与模型组无统计学差异，说明茯苓多糖对外周血白细胞数无明显升高作用。茯苓多糖低剂量组可以增加B16荷瘤鼠的脾质量和脾指数，茯苓多糖高剂量对B16荷瘤鼠的脾质量和脾指数无明显影响。茯苓多糖高、低剂量组脾质量和脾指数均高于顺铂组，说明茯苓多糖无明显免疫抑制作用，茯苓多糖高、低剂量组精神状态优于顺铂组，皮毛颜色较顺铂组光滑黑亮，说明茯苓多糖可提高小鼠生活质量。

综上所述，茯苓多糖能够抑制尾静脉注射B16荷瘤小鼠肺转移，增加其脾质量和脾指数，无明显增加其外周血白细胞数量的作用。基于笔者前期实验研究发现，茯苓多糖能够增加体外培养的大鼠中性粒细胞在肝肿瘤细胞周围形成玫瑰化环样结构，并且与增加白细胞CD11b和CD18mRNA表达相关，推测活化外周血白细胞可能是茯苓多糖抑制肿瘤转移的机制之一。

参考文献：

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[9] 周 洁,李竹庭.中药与肿瘤免疫[J].天津中医药,2004,21(3): 227-228.

[10]王爱云,陈 群,李成付,等.茯苓多糖修饰物抗肿瘤作用及其机制研究[J].中草药,2009,40(2):268-271.

（本文编辑：高 杉，于春泉）

中图分类号：R285.5

文献标识码：A

文章编号：1672-1519（2014）02-0098-04

收稿日期：（2013-11-14）

*基金项目：天津市应用基础及前沿技术研究计划重点项目（10JCZDJC21300）。

作者简介：张密霞（1975-），女，硕士，实验师，研究方向为中药药理。

通讯作者：张艳军，E-mail：zyjsunye@163.com。

Effects of pachymaran on hematogeneous lung metastasis in mice with melanoma B16

ZHANG Mi-xia,ZHANG De-sheng,ZHUANG Peng-wei,ZHANG Yan-jun
（Tianjin University of TCM,Tianjin 300193，China）

Abstract:[Objective]To investigate the effects and mechanism of pachymaran on lung metastasis in mice with melanoma B16.[Methods]C57BL/6 mice were injected with melanoma B16 cells through tail vein.After establishment of the model,mice were divided into 4 groups with ten mice each.The drug was given through the tail vein every two days in pachymaran high-dose group(pachymaran,0.5 mg every mouse),pachymaran low-dose group (pachymaran,0.33 mg every mouse),cisplatin group (cisplatin,0.04 mg every mouse),and control group (normal saline).The number of metastasis on the surface of the lung was calculated 21 days later.The number of micrometastases in lung was determined by HE staining.We also detected the count of peripheral blood leukocytes and spleen weight, spleen index at the 21st day.[Results]Cisplatin could suppress lung metastases,while reduce the body weight of mice,peripheral blood leukocyte counts,and spleen weight and spleen index.Pachymaran low-dose and high-dose groups had no effect on the body weight of B16 tumor-bearing mice.Pachymaran high-dose group could reduce the number of lung surface metastases.Pachymaran low-dose and high-dose groups could reduce the number of lung micrometastases.Pachymaran high-dose group could significantly decrease the number of the peripheral blood leukocyte but pachymaran low-dose group had no significant effect to it.Pachymaran low-dose group can increase the spleen weight and spleen index of B16 tumor-bearing mice,but low-dose group had no significant effect on them.The spleen weight and spleen index in the Pachymaran low-dose and high-dose groups were higher than the cisplatin group.[Conclusion]Pachymaran can inhibit lung metastases of B16 tumor bearing mice,increase the spleen weight and the spleen index.At the same time,it does not increase the number of the peripheral blood leukocyte.So we speculated that the activation of peripheral blood leukocytes and enhancement of immune function may be involved in the mechanism of the suppression of tumor metastasis of pachymaran.

Key words：pachymaran;B16 melanoma mice;lung metastasis;leukocyte