芳香烃受体（AhR）在乳腺癌中的表达及其与阿霉素化疗耐药的相关性

李正东杨新伟成小林庄志刚童晓文

(1同济大学附属第一妇婴保健院乳腺外科 上海 200040；2上海中医药大学附属市中医医院中医外科 上海 200071；3同济大学附属同济医院妇产科 上海 200065)

芳香烃受体（AhR）在乳腺癌中的表达及其与阿霉素化疗耐药的相关性

李正东1杨新伟2成小林1庄志刚1童晓文3△

(1同济大学附属第一妇婴保健院乳腺外科 上海 200040；2上海中医药大学附属市中医医院中医外科 上海 200071；3同济大学附属同济医院妇产科 上海 200065)

目的观察芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,Ah R)在乳腺癌组织中的表达,并探讨乳腺癌细胞AhR表达与阿霉素化疗耐药的关系。方法应用免疫组化染色法观察AhR在50例乳腺癌标本中的表达,其中淋巴结转移癌40例,正常乳腺组织10例。采用Ah R-siRNA表达载体和脂质体法瞬时转染基因沉默Ah R高表达的乳腺癌细胞株MCF-7/ADR；RT-PCR和Western bolt法检测转染后Ah R mRNA及蛋白的表达；MTT法检测细胞增殖活性及转染前后乳腺癌细胞对阿霉素敏感性的变化。结果Ah R在乳腺癌组织表达率为82.0% (46/50)、在乳腺癌转移淋巴结中表达率为92.5%(37/40),而在正常乳腺组织中10%(1/10)有表达。乳腺癌及乳腺癌转移淋巴结中AhR的表达均显著高于正常乳腺组织(P＜0.05)。基因沉默AhR高表达的乳腺癌细胞株MCF-7/ADR后24 h,PCR和免疫印迹结果均显示乳腺癌细胞株Ah R基因及蛋白表达水平降低。MTT显示AhR基因沉默对乳腺癌MCF-7/ADR细胞的增殖活性有显著的抑制作用,48 h细胞增殖抑制率可达52%。Ah R沉默后乳腺癌细胞对阿霉素的半数有效浓度(IC50)由(18.2±0.9)μmol/L降低至(8.4±1.1)μmol/L (P＜0.05)。结论siAhR能够有效抑制AhR基因的表达,降低乳腺癌细胞的增殖能力。AhR对阿霉素耐药过程发挥作用,沉默Ah R表达能一定程度上逆转阿霉素耐药现象。

乳腺癌； RNA干扰； 化疗耐药； 阿霉素

目前乳腺癌的主要治疗方法是手术结合化疗的综合治疗,而乳腺癌细胞在化疗中产生的多药耐药(multi-drug resistance,MDR)是导致化疗失败的主要原因之一［1］。由于阿霉素类化疗药物在乳腺癌辅助化疗及复发转移后的解救治疗中被广泛应用,因此研究阿霉素化疗耐药的逆转具有重要意义。

芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AhR)作为一种广泛分布于人体多个器官的配体诱导性转录因子,参与多种生物学功能的调节且与多种肿瘤的发生密切相关。文献报道Ah R在前列腺癌、肝癌、卵巢癌中均有高表达［2-4］。本研究观察AhR在乳腺癌组织中的表达情况,并采用AhR高表达的乳腺癌细胞株MCF-7/ADR,通过瞬时转染siRNA基因,探讨Ah R表达与乳腺癌阿霉素化疗耐药的关系,为临床阿霉素类化疗耐药个体提供治疗依据。

资料和方法

材料和试剂50例乳腺癌石蜡标本,其中非特殊性浸润性导管癌46例,神经内分泌癌1例,髓样癌3例。乳腺淋巴结转移癌40例,正常乳腺组织10例。组织芯片购自陕西超英生物公司(BR1008)；MCF-7/ADR细胞由复旦大学附属肿瘤医院乳腺癌研究所提供,常规培养传代；Ah R引物

序列由上海生工合成。DMEM培养基、胎牛血清、阿霉素(美国Gibico公司),DAB显色试剂盒(福州迈新生物技术有限公司),Ah R抗体(美国Invitrogen公司),脂质体2000、Ah R-siRNA(美国Santa Cruz公司),MTT(美国Promege公司),RTPCR试剂盒(美国MBI公司),兔抗人Ah R单克隆抗体及SP试剂盒(美国Biomol公司)。

免疫组化染色切片常规HE染色,采用链霉素亲和素一过氧化酶复合物法(SP法)行Ah R免疫组化染色,Ah R一抗按1∶500稀释,实验程序严格按即用型Max VisionTM试剂盒说明书进行。以肿瘤细胞胞质内出现棕黄色染色为Ah R阳性,在显微镜下采集5个不重叠的高倍视野(×400),用数字显微摄影系统拍照,由2位病理科医师分别评估。Ah R评估采用Remmele等提出的免疫反应评分(immume response scores,IRS),依据免疫组化染色范围记分为0～4(0～4个视野),染色深度记分为0～3(弱、中、强),因此染色总评分为0～12。

构建载体及细胞转染参照siRNA设计原则,结合AhR基因序列特征,设计siAhR序列。引物1：3ˊ-ATCAAGCGCTCGGGGCACCATGAACA-5ˊ,引物2：3ˊ-CCCATGGCAGCTGACGCCGAGATCTGGA-5ˊ。Ah R-siRNA组：转染si Ah R,特异性干扰目的基因AhR表达；空脂质体对照组：转染siNC,对AhR无沉默作用。将Ah R siRNA组和空脂质体组进行细胞转染处理。常规培养MCF-7/ADR细胞,使细胞密度达80%。用无血清双抗培养液稀释脂质体2000和siRNA至所需浓度,室温静置5 min,混匀,室温静置20 min,形成稳定的siRNA-脂质体混合物。将待转细胞加入上述混合物,6 h后更换培养液继续培养。

RT-pCR检测Ah R-siRNA表达转染后24 h收集两组细胞,参照Trizol说明书,提取细胞总RNA进行逆转录反应。建立PCR反应体系,以GAPDH为内参,对RT-PCR目的基因Ah R进行扩增,扩增产物为368 bp。扩增产物行琼脂糖凝胶电泳,观察各条带吸光度(D)值,用Ah R/GAPDH灰度值表示AhR mRNA相对含量。

Westernblot检测AhR蛋白表达将细胞低密度铺于6孔板,24 h后用快速制备法提取核蛋白,经电泳、转膜后杂交,一抗为兔抗人Ah R单抗,二抗为鼠抗兔多抗,以NBT/BCIP显色。采用图像处理仪分析处理,测定D值并计算其与空白对照组的比值。

MTT法检测细胞增殖按上述为法处理细胞,处理后24、48、72和96 h分别收集细胞,行MTT染色,酶标仪下570 nm波长处测定D值,计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率(%)=(空白组D值-处理组D值)/空白组D值×100%。

MTT法检测耐药逆转效果转染后48 h收集细胞,细胞浓度整至1×105/m L,取单细胞悬液100 μL,加入终浓度为0.1、1、10、100μmol/L的阿霉素,常规MTT法检测试验细胞和耐药细胞的生存率,每个浓度梯度均设对照组和空白调零孔。在酶标仪上以570 nm和630 nm双波长检测D值。终D值=D570-D630,TCL=加药组D值/对照组D值×100%。实验重复3遍,取平均值,采用Graphpad Prism软件计算IC50。

统计学处理统计学分析采用SPSS 13.0软件,计量资料用x—±s表示,两组间比较采用t检验。采用双侧检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

AhR在乳腺癌、乳腺癌转移淋巴结及正常乳腺组织中的表达应用免疫组化方法发现,Ah R在82.0%的乳腺癌组织(46/50)、92.5%的乳腺癌转移淋巴结(37/40)及10%的正常乳腺组织(1/10)中均有表达。免疫组化阳性染色主要表达于肿瘤细胞的胞质,乳腺癌组织中的表达阳性率及表达水平均高于癌旁正常乳腺组织。采用IRS评估Ah R免疫组化,乳腺癌组及乳腺癌转移淋巴结组的评分均明显高于乳腺癌劳正常组织(P＜0.05)。而乳腺癌组与乳腺癌转移淋巴结组之间的评分无统计学差异(P＞0.05,图1)。

siRNA转染后细胞的AhRmRNA表达空载体组和siRNA组细胞在452 bp处均扩增出GAPDH条带,扫描D值在24 h时基本相同。转染24 h后siAhR组在368 bp处可见浅扩增条带,而对照组在相应部位可见特异性条带(图2)。转染24 h后,siAhR组的Ah R mRNA相对表达量明显低于阴性对照组,说明siRNA成功干扰目的基因AhR的mRNA表达。

AhR-siRNA表达质粒对AhR蛋白表达的影响MCF-7/ADM乳腺癌细胞转染siAh R后24 h,Ah R蛋白水平显著低于对照组,表明转染后MCF-7/ ADR的AhR基因表达受到抑制(图3)。

转染siAhR后对乳腺癌细胞增殖活性的影响由细胞生长曲线可见,si Ah R转染乳腺癌细胞MCF-7/ADR后细胞增殖活性明显受到抑制(P＜0.05),48 h抑制率可达52%(图4)。

转染前后乳腺癌细胞对阿霉素敏感性的变化siAhR组、空脂质体对照组阿霉素IC50值分别为(8.4±1.1)和(18.2±0.9)μmol/L。siAh R组明显低于对照组(P＜0.01),结果提示AhR表达水平下调后,乳腺癌细胞MCF-7/ADR部分恢复了对阿霉素的敏感性,阿霉素耐药性得到逆转(图5)。

讨 论

化疗药物的原发或继发耐药是导致乳腺癌患者临床化疗失败的主要原因之一。阿霉素类药物是目前临床上治疗乳腺癌最常用的药物,其在乳腺癌术后辅助化疗、新辅助化疗及复发转移的解救化疗中均发挥着重要作用［5］,因此研究乳腺癌的阿霉素类药物耐药具有明确的临床意义［6］。阿霉素耐药机制多样,目前仍不能确定。现认为肿瘤最常见的耐药机制是多药耐药糖蛋白介导的MDR［7］,因此多药耐药糖蛋白数量的增多也是化疗失败的原因之一。对于乳腺癌化疗耐药,可以通过逆转MDR来提高化疗药物的敏感性［8］。

Ah R作为肿瘤相关蛋白和生物治疗靶点越来越受到重视［9］。Ah R与多种细胞增殖活性、细胞周期及肿瘤的生长方式、侵袭等生物学行为密切相关,进而有可能影响化疗效果［10］。对AhR基因敲除鼠模型的研究显示,Ah R可影响生物的生殖、生存和生长,而细胞培养发现通过外源性Ah R配体激活及干扰会影响细胞黏附及基质代谢相关蛋白的表达(如基质金属蛋白酶)［11］。这些研究结果都支持AhR可能通过影响细胞间黏附、基质代谢而调整细胞行为及信号反应。而细胞外黏附、基质降解和基底膜破坏是肿瘤细胞侵袭和转移过程中的重要环节。尽管Ah R在实体瘤中的研究已经逐步开展,但是Ah R在人类乳腺癌发生、发展过程中的功能仍不清楚。Ah R不仅在人类乳腺癌组织中高表达,动物实验也表明乳腺不同发育时期的Ah R配体TCDD暴露决定了患乳腺癌的危险性［12］。这些现象均表明Ah R在乳腺癌进展过程中发挥一定的作用。此外,Ah R与雌激素受体(estrogen receptor,ER)之间存在抑制性交互应答(inhibitory Ah R-ER crosstalk),从而发挥抗雌激素效应［13］。其机制可能为Ah R被外源性配体激活后发生Ah R-ER相互作用,引起ERα降解,进而抑制雌激素诱导的c-fos转录,并引起编码组织蛋白酶D(cathepsin D)、p27和BRCA1等相关基因的转录下调［14］。

我们通过组织芯片观察到,在乳腺癌组织及乳腺癌转移淋巴结中Ah R表达明显高于正常乳腺组织,而在乳腺癌与乳腺转移淋巴结之间未见明显差异。本研究未观察到Ah R与乳腺癌转移的关系,下一步将通过扩展样本量及分层分析,以期在临床病理方面有所发现。经基因及蛋白检测证实乳腺癌细胞MCF-7/ADM中Ah R呈高表达。通过siRNA特异性抑制Ah R基因,MCF-7/ADM的细胞增殖受到抑制,其对阿霉素的反应性明显增强,耐药性在一定程度上得到逆转。本实验说明Ah R在乳腺癌细胞阿霉素耐药方面存在一定作用,推测机制除了与Ah R对乳腺癌细胞增殖的抑制作用有关以外,还可能与MDR等对抗阿霉素药物诱导的细胞凋亡相关。曾有报道在小鼠肝癌模型中Ah R与P53介导的多药耐药基因MDR1相关。本实验还证实siRNA抑制Ah R基因表达的可行性,为进一步开展将AhR作为乳腺癌阿霉素增敏新靶点的研究提供了一定的实验基础。

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Aryl hydrocarbon receptor（AhR）expression in breast cancer tissues and its association with adriamycin chemotherapy resistance

LI Zheng-dong1,YANG Xin-wei2,CHENG Xiao-lin1,ZHUANG Zhi-gang1,TONG Xiao-wen3△
(1Department of Breast Surgery,First Maternal and Infant Healthcare Hospital,Tongji University,Shanghai 200040,China；2Department of Surgery of TCM,Municipal Hospital of Shanghai Traditional Chinese Medicine,Shanghai 200071,China；3Department of Gynaecology and Obstetrics,Tongji Hospital,Tongji University,Shanghai 200065,China)

Objective To investigate both the expression of aryl hydrocarbon receptor(Ah R)in breast cancer tissues and its association with adriamycin chemotherapy resistance.MethodsAh R expression was observed by immunohistochemical staining in 50 specimens of breast cancer containing 40 cases of metastasis lymph nodes and 10 cases of normal breast tissues.Breast cancer cell line MCF-7/ADR with Ah R high expression was transfected by the Ah R-siRNA liposome vector.The expression of Ah R mRNA and protein was detected by RT-PCR and Western blot after transfection.Adriamycin sensitivity of breast cancer cells before and after transfection was determined by proliferation test,MTT.ResultsAh R in immunohistochemical staining was expressed in 82%(46/ 50)breast cancer tissue,in 92.5%(37/40)metastasis lymph nodes,and in 10%(1/10)normal breast tissue.AhR expression in normal breast tissues was significantly lower than that in breast cancers and metastasis lymph nodes(P＜0.05).PCR and Western blot results showed that expression of AhR gene and protein in breast cancer cell line MCF-7/ADR was decreased 24 hours later after Ah R gene silencied by liposome transfection.The proliferation of breast cancer cell MCF-7/ADR was significantly inhibited after Ah R gene was silenced.MTT showed the inhibition rate of cell proliferation was up to 52%at 48 hours.Median effective concentration(IC50)to adriamycin was decreased from(18.2±0.9) μmol/L to(8.4±1.1)μmol/L(P＜0.05)before and after AhR-silenced in breast cancer cells.ConclusionsAhR-siRNA can effectively inhibit the expression of AhR gene and reduce the proliferation of breast cancer cell.Ah R plays a role in adriamycin resistant process,so that Ah R silencing can partly reverse adriamycin resistant in breast cancer.

breast cancer； RNA interference； chemotherapy resistance； adriamycin

R 735.9

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.01.015

2013-08-27；编辑：王蔚)

上海市科委资助课题(134119a7900)

△Corresponding author E-mail：xiaowen_tong@yahoo.com

*This work was supported by Shanghai Municipal Science and Technology Commission Foundation(134119a7900).