山羊多胎性状候选基因的研究进展

马晓丽，刘开东，贺建宁，柳 楠＊

（1.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛266109；2.青岛市畜牧兽医研究所，山东青岛266200）

繁殖性状是山羊的主要经济性状之一，繁殖性能直接关系到山羊产业的经济效益。山羊的多胎性属于繁殖性状，遗传力较低，通过常规选育效果不明显；现代分子遗传学和育种学的发展，尤其是主效基因理论的应用弥补了传统育种的不足。因此，通过研究山羊多胎性能的遗传机制、寻找山羊多胎性状的主效基因、加快山羊多胎性状的选择进展，对于我国山羊产业的发展具有重大意义。本文就有关山羊多胎性状候选基因的研究进行综述，以期为分子标记辅助选择在山羊多胎性状的选择方面提供理论依据。

1 促性腺激素释放激素（GnRH）及其受体（GnRHR）基因

促性腺激素释放激素（Gonadotropin－releasing hormone，GnRH），是一种由脑组织分泌的十肽神经激素，它是下丘脑－垂体－性腺轴的关键神经内分泌调节因子。这种十肽小分子由下丘脑的神经内分泌细胞分泌，然后进入门静脉系统随血流进入垂体，并与位于垂体前叶的促性腺激素细胞上的特异性受体（GnRHR）结合，从而刺激垂体细胞分泌黄体生成激素（Luteining hormone，LH）和卵泡刺激激素（Follicle－stimulating，FSH），进而促进性腺的生长、成熟和调控哺乳动物的繁殖力［1］。GnRHR 是位于垂体促性腺细胞表面的一种G 蛋白耦联受体，转导GnRH 信号，并调节LH 和FSH 的合成和分泌。董伟等［2］研究发现肠系膜后神经节中存在的GnRHR 是协调生殖活动中GnRH 内分泌调节和自主神经调节两种调节机制功能的中转站。哺乳动物的GnRH基因由4个外显子和3个内含子组成，位于山羊的第8号染色体上。GnRH基因的研究主要集中在人类性早熟方面［3］。Montgomery等［4］通过研究把绵羊的GnRH基因定位到6号染色体上。Campion等［5］获得了绵羊GnRH基因完全的编码序列，绵羊GnRHR基因由3个外显子和2个内含子组成。MacColl等［6］通过研究发现，若某种生物的GnRH 或GnRH基因的蛋白表达受到抑制或是发生了突变，则会导致个体不育。Ikemoto等［7］发现GnRH及其受体的相互作用是调节动物繁殖性能的一个关键位点。

颜泉梅等［8］根据牛GnRH基因序列设计了4对引物，分别扩增该基因的4个外显子和3｀UTR，采用PCR－SSCP技术检测西农莎能奶山羊和布尔山羊GnRH基因的多态性。发现两种山羊的GnRH基因4个外显子相对保守未出现突变，第3内含子和3｀UTR 处出现突变，在西农莎能奶山羊和布尔山羊群体中，CC和CT 基因型个体产羔数均显著高于TT 基因型（P＜0.05）。An 等［9］在641 只波尔山羊、西农萨能奶山羊和关中奶山羊的群体中研究发现GnRH基因存在两个突变位点，这两个突变位点对于不同胎次母羊的产羔数影响不同。

肖杰文［10］研究表明，在济宁青山羊中发现GnRHR基因外显子1存在一个G→A 碱基的突变，该突变虽然未引起氨基酸的改变，但对济宁青山羊的产羔数存在显著影响。张育军等［11］采用PCRSSCP技术，用3 对引物鉴定了黄淮山羊促性腺激素释放激素受体（GnRHR）基因外显子2和外显子1部分序列的多态性，并对其基因多态性与产羔数的关联性进行了分析。结果表明，在黄淮山羊中，外显子1存在1个突变（C→A），并且突变型比野生型个体平均产羔数多0.66只（P＜0.05）。An等［12］研究发现GnRHR基因外显子1在不同的山羊品种中存在突变并且与产羔数有密切关系，断定该基因是山羊多胎性状的候选基因。

2 催乳素受体（PRLR）基因

催乳素（prolactin，PRL）是脊椎动物腺垂体前叶嗜酸细胞、妊娠子宫蜕膜和免疫细胞等分泌的单链多肽类激素，属于生长激素／催乳素家族。它在促进哺乳动物个体的乳腺发育、乳汁生成、发动和维持泌乳方面发挥重要作用。PRL 通过与靶细胞膜表面的催乳素受体（prolactin receptor，PRLR）结合，启动JAK2／STAT5 信号传导途径，最终激活反式作用因子STAT5，使其作用于乳蛋白基因启动子区的靶序列，启动或增强以乳蛋白基因启动子为作用元件的靶基因（包括外源基因）的表达。PRLR基因有10个外显子，定位于山羊的20 号染色体上［13］。PRLR基因缺失可引起哺乳动物卵泡发育、受精障碍等诸多生殖方面的异常，导致不孕或生育能力下降［14］。因此，国内外许多学者将PRL 受体基因作为影响家畜产仔数的候选基因，研究它们对家畜产仔性能的影响。

康峰［15］揭示PRLR基因的两个位点（内含子I和II）在冀中山羊中具有多态性，内含子II属于低度多态，而内含子I属于高度多态。内含子I对冀中山羊的第一胎产羔数、第二胎产羔数均无明显影响。而内含子II对冀中山羊的第一胎产羔数、第二胎产羔数均有较大影响。张跟喜等［16］针对催乳素受体基因外显子10及部分3｀非翻译区设计了5对引物，经PCR－SSCP技术检测发现济宁青山羊催乳素受体基因外显子10 中发生1 处碱基突变（A→G），杂合型比野生纯合型个体产羔数多0.76 只。研究结果初步表明：PRLR基因可能是控制济宁青山羊多胎性能的一个主效基因或是与之存在紧密遗传连锁的一个标记。

3 促黄体素（LH）基因

促黄体素（LH）是一种糖蛋白激素，由垂体前叶嗜碱性细胞合成和分泌，可促进卵泡成熟并分泌雌激素、触发排卵、促进黄体形成，促进雄性动物附性腺的发育和精子的成熟。糖蛋白激素都由α和β两个亚基共轭结合而组成，在同一种内甚至是所有哺乳动物中，α亚基为它们共有，而β亚基具有物种和激素的特异性［17］，因此对于LH 的研究重点在β亚基。LHβ基因发生突变，可能会导致LHβ表达量降低、与受体结合的活性部位发生失活或部分失活，这些均会导致G 蛋白偶联及信号传递发生障碍，进而对家畜的产仔数产生影响［18］。

李利等［19］以南江黄羊246个个体作为研究材料，采用PCR 扩增并以SphI酶切分析山羊LHβ基因，比较不同基因型的繁殖性能。结果检测到3个基因型，山羊1～5胎的初生窝重及产羔数在各基因型间差异不显著，但从第2胎开始突变纯合型母羊的产羔数和窝重较其它两种基因型个体稍大。孙瑞萍等［20］在研究布尔山羊和西农萨能奶山羊LHβ基因多态性及其与产羔数的相关性时发现，5｀端调控区的碱基突变导致布尔山羊第3、4胎产羔数明显增加，而西农萨能奶山羊第4、5胎产羔数在突变型纯合与杂合个体间差异显著。

4 卵泡刺激素（FSH）及其受体（FSHR）基因

卵泡刺激素（Follicle Stimulating Hormone，FSH）是一种由垂体分泌的糖蛋白激素，它与上面提到的促黄体素都属于α／β异二聚体糖蛋白激素家族的成员。FSH 在雌性哺乳动物中主要的生理作用是刺激卵泡发育和排卵，在雄性动物中它能诱导雄性动物曲精细管生长、维持精子生成、刺激睾丸间质细胞发育。 卵泡刺激素受体 （Follicle Stimu1ating Hormone，FSHR）是FSH 的特异性受体，FSH 发挥作用必须由FSHR 来介导。FSHR 属于G 蛋白偶联受体家族中的成员，通过cAMP通路介导FSH 的信号转导。二者对提高雌性哺乳动物的产仔数具有重要的作用。FSHα、β亚基均参加受体结合与信号转录作用，α亚基基因包括3个外显子和3个内含子，β亚基基因由3个外显子和2个内含子组成。同其他α／β异二聚体糖蛋白激素家族的成员一样，同一物种中α亚基基因相同，β亚基基因存在特异性。FSHβ亚基基因突变可能引起表达量的改变，影响信息物质的结合和传递，改变卵泡激素对负反馈调节的敏感性和阈值，或改变卵泡同期化发育程度，从而影响排卵率［21］。Sprengel等［22］成功克隆了FSHR cDNA 序列，多数哺乳动物的FSHR cDNA 开放阅读框由2085个核苷酸构成。

梁琛等［23］检测了济宁青山羊FSHβ的多态性，结果表明：外显子2的扩增片段在济宁青山羊、辽宁绒山羊和波尔山羊中均检测到3种基因型；3种基因型对于济宁青山羊的产羔数有显著的影响。杜林等［24］在以天府肉羊、成都麻羊、波尔山羊为研究对象，研究发现试验羊FSHβ基因5｀调控区第712碱基处存在一个A→G 碱基突变，导致天府肉羊、波尔山羊出现3种基因型（AA、AB、BB），成都麻羊而只出现2种基因型（AA、AB）。天府肉羊经产平均窝产羔数AA 型和AB均显著高于BB；而波尔山羊平均窝产羔数各基因型间差异均不显著。成都麻羊平均窝产羔数均AB型显著高于AA。

姜怀志［25］研究发现，辽宁绒山羊FSHR基因第10外显子突变率较大，可以作为双羔和单羔型的标记基因。朱吉等［26］在研究山羊FSHR基因5｀端多态性与产羔数性状的关系时发现，贵州黑山羊FSHR基因5｀端多态性对于产羔数有显著的影响，且BB 基因型显著高于AA 型和AB 型。基因FSHβ、FSHR在高产乐至黑山羊和低产的西藏山羊两个品种间表达差异显著，说明这两个基因可能是造成高产和低产的一个重要原因［27］。

5 KISS－1基因及GPR54基因

KISS－1基因是Lee等［28］1996年研究人黑色素细胞不同转移能力时发现并命名的。该基因定位在人类染色体1q32－41上，包含4个外显子和3个内含子。该基因通过G 蛋白偶联受体54介导在哺乳动物生殖内分泌中发挥着重要的调控作用。近年的研究表明，KISS－1基因还具有调控肿瘤转移、子宫滋养细胞浸润、动物青春期发育、能量平衡以及生物节律的功能［29］。

曹贵玲等［30］设计了3 对引物克隆山羊的KISS－1基因并扫描其序列的多态性，4对引物用于性早熟和性晚熟山羊品种多态性的检测，获得了4 118bp的DNA 片段，含有长408的开放阅读框，编码135个氨基酸，并且发现在内含子1中发现3个突变位点（G296C、G454T 和T505A），G296C 突变位点与济宁青山羊的产羔数相关；外显子2中没有发现突变位点；内含子2 中发现1 个18bp 缺失（－）／插入（＋）突变（1960－1977），外显子3中发现两个突变位点（G3433A 和C3688A）；这些突变位点在性早熟和性晚熟品种之间的基因型分布没有明显差异。安晓鹏等［31］在研究山羊的KISS－1＇基因遗传标记与产羔数的试验中发现，萨能奶山羊和关中奶山羊KISS－1基因g.384G突变为A，出现3 种基因型，平均产羔数AA型均显著高于GG型。波尔山羊KISS－1基因g.2510G突变为A，AA型产羔数显著高于GA型。在济宁青山羊品种中PR54基因外显子5 存在3 个突变位点（G4014A、G4136A、C4152T），C4152T导致基因型TT、CT比CC产羔数多1.02只和0.84（P＜0.01）［32］。在研究关中奶山羊和西农萨能奶山羊时发现该基因的内含子2的突变同样会导致不同基因型的产羔数差异［33］。

6 INHA 基因

抑制素是由睾丸支持细胞和卵巢颗粒细胞分泌的糖蛋白激素，是由α－和β－两个亚基组成的异二聚体，通过调节FSH分泌水平影响哺乳动物繁殖性能。抑制素A极可能作为卵泡发育数量的信号，调控垂体FSH分泌，从而调节排卵数。INHA 基因多态性在家畜上均有报道，多数突变均导致母畜不同程度繁殖机能的改变。

滑国华等［34］以323 只马头山羊、努比山羊、波尔山羊和海门山羊为试验材料，利用PCR－SSCP、PCR－RFLP和克隆测序等方法对山羊抑制素α亚基基因（INHA）编码区一个片段进行多态性分析，发现在该基因第284 位存在G→A突变，HaeⅡ－RFLP分型结果显示G等位基因为优势等位基因，INHA不同基因型平均产羔数表现为GG＞AG＞AA。结果显示：INHA可能是影响山羊产羔数性状的一个主效基因，G等位基因可能与高产性状呈正相关。董李学等［35］在研究辽宁绒山羊双羔性状时，以INHA 基因为候选基因，运用测序法在INHA 基因的启动子区域找到一个多态位点，该等位基因在双羔和单羔群体中分布处于中度多态，不同基因型在辽宁绒山羊单、双胎群体上差异显著，BB基因型产羔数比AA基因型多产羔0.429 只。在西农萨能奶山羊、关中山羊和波尔山羊的研究中发现，INHA＇基因的其中一个突变导致三个山羊品种内不同基因型产羔数差异［36］。

7 BMP15基因

骨形态发生蛋白15（bonemorphogenetic protein15，BMP15）基因位于X 染色体上，是转移生长因子－β超家族生长因子的一种分泌型信号分子，仅在卵母细胞中特异性表达。1965年Marshall等［37］用在皮下植入动物脱钙骨基质及动物肌肉的方法首先发现BMPs的存在。迄今为止已发现20 多种BMPs，而BMP15 是BMPs 中非常重要的一种，BMP15通过促进颗粒细胞有丝分裂、抑制促卵泡素受体在颗粒细胞中表达来调节颗粒细胞增值和分化，在哺乳动物生殖中起重要的作用［38－39］。BMP15基因仅在卵母细胞中表达，因而该基因被认为与动物繁殖性状相关［40］。

林尖兵等［41］在研究贵州白山羊BMP15 基因的多态性研究中发现高产母羊有BMP15 基因FecXB突变存在，低产母羊没有检测到该突变。冉雪琴等［42］对贵州白山羊BMP15 基因多态性分析发现7 个在成熟肽中的氨基酸突变位点D17G、P50L、L65H、H70Y、V85A、P911I和G107R，其中P911I与绵羊中已发现的FecXB突变位点相同。储明星［43］等通过PCR－SSCP 分析方法在济宁青山羊BMP15基因中发现多态性，经测序发现了两个碱基突变分别是编码区963处的G→A 和1050处的G→C突变。肖杰文等［44］在济宁青山羊、文登奶山羊、内蒙古绒山羊等山羊中均检测到了FecXL 突变。Abdel－Rahman SM 等［45］在研究努比亚山羊时发现，BMP15外显子2基因多态性与其产羔数有显著差异。Pramod 等［46］进行了Black Bengal 和Sirohi两个山羊品种卵巢形态测量和成熟卵泡的数量和大小的比较，并通过实时定量PCR 发现BMP15和GDF9基因在不同大小的成熟卵泡中的差异表达，说明这两个基因可以作为高繁殖力筛选重要依据。

8 GDF9基因

生长分化因子9（growth differentiation factor，GDF9）是转化因子β超家族的成员之一，主要在卵巢组织中表达，它由卵母细胞分泌，是卵泡生长过程中不可或缺的细胞因子。GDF9基因位于常染色体上，有两个外显子和一个内含子组成。Sadighi等将绵羊GDF9 基因定位在5 号染色体上［47］。Dong等［48］敲除GDF9 基因外显子2 的杂合子小鼠gdf9mI／＋进行杂交，发现纯合子gdf9mI／gdf9mI的雄性小鼠能正常繁殖，而雌性小鼠卵泡停止发育。

周泽晓等［49］在贵州白山羊的高产羊群和低产羊群GDF9 基因外显子2 的790 位点都检测到了AA、AB两种基因型，AB基因型个体的产羔数较多（P＜0.05）。颜泉梅［50］在研究西农萨能奶山羊时发现GDF9外显子2 存在多态性，存在AA、AG 和GG 三种基因型。经测序发现AA 基因型和GG 基因型相比存在一处突变，位于扩增片段127bp A→G。在西农莎能奶山羊群体中，AA 基因型个体的第二、三胎产羔数和平均产羔数极显著高于AG 和GG 基因型个体（P＜0.01），AG 基因型个体的各胎次和平均产羔数均极显著高于GG 基因型个体（P＜0.01）。在布尔山羊群体中，AA 基因型个体的各胎次产羔数和平均产羔数均极显著高于AG 和GG基因型（P＜0.01）；AG 基因型仅第1胎产羔数显著高于GG 基因型（P＜0.05）。在研究高繁殖力山羊品种（济宁青山羊）与低繁殖力的山羊品种的GDF9基因（P＜0.01）中，发现在高繁殖力与低繁殖力的山羊品种中该基因的突变位点导致的不同基因型频率差异显著，且济宁青山羊不同基因型产羔数差异显著（P＜0.01）［51－52］。安晓鹏等［9］以西农萨能奶山羊、波尔山羊和关中奶山羊为研究对象，发现这三种羊的GDF9基因存在一个位点的突变，且该突变对产羔数有显著的影响。

综合以上研究结果，目前尽管对影响山羊多胎性状的基因及标记进行了大量研究，但多数只是简单的关联分析，而对发现的突变位点及候选基因并未做进一步的功能验证，且不同山羊品种影响多胎性状的基因或标记不同。如何确定山羊多胎主效基因及其功能验证还需要更深入的研究。利用我国丰富的山羊品种资源筛选出增加排卵数和产羔数的多胎主效基因，并进行标记辅助育种研究，对提高其繁殖性能、增加山羊产业的经济效益具有十分重要的科学意义。

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