喜马拉雅旱獭弓形虫病血清学检测

乔海生，蔡其刚，马利青

（青海省畜牧兽医科学院，青海西宁810016）

刚地弓形虫（Toxoplasmagondii）可专性寄生于人和动物的除红细胞以外的有核细胞内，是一种重要机会致病性原虫，能够引起人和动物弓形虫病（Toxoplasmosis）［1］。刚地弓形虫速殖子期特异性P30蛋白，也称表面抗原1（SAG1），能够诱导机体产生IgG、IgM 等多种细胞因子，具有重要的抗原性［2］。Dzierszinski等［3］研究认为P30蛋白可能是决定弓形虫虫株毒力的重要因素之一。

喜马拉雅旱獭是青藏高原分布广泛的一种野生动物，可传播鼠疫等致病微生物，严重威胁着当地人畜的安全。为了解青海省喜马拉雅旱獭体内弓形虫病的感染情况，本研究应用弓形虫的重组蛋白GST－SAG1 作为ELISA 诊断抗原，采用ELISA 检测方法，对青海省祁连县的92份喜马拉雅旱獭血清进行了弓形虫病的血清学检测，结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料

青海省某地捕获旱獭92只，现场心脏采血，立即离心（3 000rpm，15min），分离血清，－20℃条件下冷冻保存待检。谷胱甘肽巯基转移酶（Glutathione S－transferase，GST）和GST－SAG1抗原由青海省畜牧兽医科学院兽医生物技术研究室制备。标准阴性、阳性血清由日本玄学南博士提供。

1.2 ELISA 方法

1.2.1 重组蛋白的表达、纯化 GST－SAG1融合蛋白采用将编码T.gondii SAG1 的基因克隆到pGEX－4T－3 质粒，然后转化到E.coli的方法获取。再用8 M 的尿素缓冲液透析复性，然后作为诊断抗原在T.gondii的ELISA 检测中应用。

1.2.2 抗原的包被 包被液中（50mM Carbonate－Bicarbonate Buffer，pH 9.6）分别按5μg／mL 剂量加入GST 和GST－SAG1抗原，混匀后以每孔50μL加到96孔平底微量板（Castor）的孔中，并且置4℃条件下孵化过夜。

1.2.3 封 阻 用含有0.05% Tween 20 的1×PBS冲洗液冲洗1 次后，再用含3% 脱脂乳的封阻液（3g脱脂奶粉＋90 mL 蒸馏水＋10 mL 10×PBS）进行封阻（每孔100μL），并且置37℃条件下孵化1h。

1.2.4 加 样 用冲洗液冲洗微量板1 次，将标准阴性、阳性血清和被检血请在封阻液中按1∶100滴度稀释后，每个样品每孔50μL 平行加到微量板的两个孔中，且置37 ℃条件下孵化1h。

1.2.5 加二抗 用冲洗液冲洗微量板6 次后，将用辣根过氧化物酶标记的Protein A 抗体，在封阻液中按1∶4000 滴度稀释后每孔加入50μL，且置37 ℃条件下孵化1h。

1.2.6 底 物 用冲洗液冲洗酶标板6 次后，每孔加100μL 底物（每1 mL 底物中含有0.3μg ABTS，pH4.0的0.1 M 柠檬酸缓冲液和0.003%过氧化氢），室温避光孵化1h，在酶标仪上读数。

1.2.7 读 数 用TECAN Sunrise－Basic酶标仪（SUNRISE，Swiss）在OD415nm条件下测定光吸收值（OD）。

1.2.8 判定标准 按照管刚等［4］介绍的方法进行判定。

2 结果

本研究从92份喜马拉雅旱獭血清中，共检出阳性血清25份，阳性率27.17%。结果表明青海省祁连县喜马拉雅旱獭中存在弓形虫病的感染。

3 讨论

喜马拉雅旱獭感染弓形虫病研究具有重要的流行病学意义。野生动物和家畜及人类共处一个草场，共用相同的水源，感染了弓形虫的中间宿主野生动物有被人类食用或被终末宿主猫科动物捕食的可能。野生动物感染弓形虫，构成了对人和家畜安全的威胁，所以对野生动物、家养动物、野生动物和家养动物间的相互传播机理以及动物模型需要做进一步研究。

本研究共检测了92份喜马拉雅旱獭血清，检出阳性数25份，阳性率27.17%，与蔡进忠等［5］采用简接血凝（IHA）对青海家畜弓形虫病血清抗体检测结果相比，高于牦牛的8.03%、羊的7.81%、猪的11.86%。说明弓形虫在青海省家畜和野生动物体内均有感染，而且野生动物感染率明显高于家畜，虽然这与检测方法不同等因素有关，但也提示需研发更加简便、标准统一的检测方法，并对野生动物弓形虫感染的检测和防治需要引起高度重视。

［1］El KouniM H.Adenosine metabolism in Toxoplasma gondii：potential targets for chemotherapy［J］.CurrPharJ－Teisai Des，2007，13（6）：581－597.

［2］Seng S，Makala L H，Yokoyama M，et al.SAG1is a hosttargeted antigen for protection against toxoplasma gondii infection［J］.Pathobiology，2004，71（3）：144－151.

［3］Dzierszinski F，Mortuaire M，Cesbron－Delauw M F，et al.Targeted disruption of the glycosylpho sphatidylinositol－anchored surface antigen SAG3gene in Toxoplasma gondii decreases host cell adhesion and drastically reduces virulence in mice［J］.Mol Microbiol，2000，37（3）：574－582.

［4］管 刚，牛小迎，马利青.猪弓形虫病的ELISA 诊断及试剂盒建立.中国兽医杂志［J］.2008，44（6）：83－84.

［5］蔡进忠，李春花.青海家畜弓形虫病血清学调查与流行情况分析［J］.中国兽医杂志，2011，47（1）：45－46.