利用PiggyBac转座系统构建稳定表达鹅RIG-I的DF-1细胞系

胡 跃，孙英杰，王晓旭，仇旭升，宋翠萍，谭 磊，胡桂学，丁 铲

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；3.安徽农业大学动物科技学院，合肥 223006）

利用PiggyBac转座系统构建稳定表达鹅RIG-I的DF-1细胞系

胡 跃1，孙英杰2，王晓旭3，仇旭升2，宋翠萍2，谭 磊2，胡桂学1，丁 铲2

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；3.安徽农业大学动物科技学院，合肥 223006）

维甲酸诱导基因-I（retinoic acid inducible gene-I，RIG-I）是最近几年发现的一种细胞内模式识别受体，能够特异性的识别并结合病毒RNA，进而发挥抗病毒效应。RIG-I在进化中相对保守，但已有报道和我们的前期研究显示：家禽中鸭和鹅体内均有RIG-I受体，但鸡却缺乏RIG-I受体。为了研究这种天然缺失对鸡是否有不利影响，本研究利用PiggyBac转座系统将鹅源RIG-I转染入鸡胚成纤维细胞系DF-1，两次亚克隆后获得单个克隆，以荧光、RT-PCR及Western blot进行鉴定，最终获得稳定表达鹅RIG-I的DF-1细胞系，为进一步研究鸡的先天性免疫机制和鹅RIG-I的功能打下基础。

鹅维甲酸诱导基因-I；鸡胚成纤维细胞系DF-1；PiggyBac转座系统

先天性免疫是机体对抗外来病原微生物侵害的第一道屏障，而在感染初期模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）识别病原微生物入侵机体后复制过程中产生的一些保守组分，即病原体相关分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs），是有效发挥先天性免疫反应的第一步[1]。机体内的PRRs目前主要分为四大家族：Toll样受体家族（Toll-like receptors，TLRs），RIG-I样受体家族（RIG-I like receptors，RLRs），NOD样受体家族（NOD-like receptors，NLRs）和C型外源凝集素受体（C-typed lectin receptors，CLRs）[2]。

维甲酸诱导基因I（retinoic acid inducible gene-I，RIG-I），又称为视黄酸诱导基因I，2004年由日本科学家Takahashi首先发现。RIG-I是细胞质内蛋白，N端是两个串联的半胱天冬酶活化募集结构域（caspase activation and recruitment domain，CARD），中间部分为具有DExD/H盒的RNA解旋酶结构域，包含与ATP结合的关键位点，C端是与RNA结合的结构域（RNA-binding domain）和抑制结构域（repressor domain，RD），其中具有RNA识别、信号抑制功能的区域，又称为C末端结构域（C-terminal domain，CTD）。虽然RIG-I基因在进化中相对保守，但在鸡的基因组中并不存在RIG-I的核苷酸序列，这意味着鸡先天性缺失这一模式识别受体[3,4]。鸡是我国各地普遍饲养的一种重要的经济动物，与鸡相比，鸭和鹅对许多病毒都有较强的抵抗力，如新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）、禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV），目前已有研究表明NDV、AIV侵入机体后，病毒复制时所产生的RNA主要由RIG-I负责识别、结合[5,6]，激活先天性免疫反应，发挥抗病毒作用。

PiggyBac（PB）转座子属于DNA转座子，能够针对基因组TTAA位点进行基因插入，具有较高的转座效率。PB转座系统是一种比较理想的非病毒载体，与病毒载体相比，其安全性高、成本低、载体容量大，且操作相对简单，转座效率高、转座后可切离、转座后不引起染色体重排等现象，是目前较理想的转基因载体。为了便于研究鸡对于RIG-I的先天性缺失是否使鸡对于NDV、AIV以及其他病毒更易感，本研究利用PiggyBac转座系统构建了稳定表达鹅源RIG-I基因的鸡传代细胞系，为后续研究打下基础。

1 材料和方法

1.1 细胞DF-1细胞由扬州大学秦爱建教授馈赠，用含10%胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）的DMEM培养基培养；原代鸡胚成纤维细胞（chicken embryo fibroblast，CEF）用含10%FBS的DMEM培养基培养；本研究中所用的鸡胚为北京梅里亚维通实验动物技术有限公司产品。

1.2 载体和试剂PiggyBac转座系统由西北农林科技大学周恩明教授馈赠；嘌呤霉素、氨苄青霉素、人β-actin抗体为Sigma公司产品；质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒为天根生化科技有限公司产品；内切酶为TaKaRa公司产品；KOD酶为TOYOBO公司产品；转染试剂lipofectamine 2000为life Technologies公司产品；蛋白酶抑制剂PMSF、叠氮钠、Western及IP细胞裂解液、增强型BCA蛋白浓度检测试剂盒、一抗二抗去除液、显影液定影试剂盒为中国碧云天生物技术研究所产品；鹅RIG-I多克隆抗体为本实验室制备。

1.3 引物设计参照GenBank中鹅源RIG-I的CDS（GenBank登录号：HQ829831.1），设计了包含酶切位点Xba I和EcoR I的扩增引物，以及用于RT-PCR鉴定的特异性鉴定引物。同时针对PiggyBac载体序列设计了一对特异性鉴定引物，以及包含RIG-I及部分载体的鉴定引物。上述3对鉴定引物均通过BLAST特异性验证，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表1。

1.4 细胞敏感性实验分别配制嘌呤霉素终浓度为1～10 μg/mL的含5%FBS的DMEM培养基。在24孔板内饲养DF-1细胞，待细胞长至80%左右时更换为含药物的培养基，每个浓度设4个重复，每块6孔板设1组正常培养基为对照组。每24 h观察细胞形态并记录，每3 d更换培养基，持续8 d。

1.5 PiggyBac-RIG-I质粒的构建和鉴定鹅源RIG-I扩增的PCR体系按照KOD-Plus-Neo DNA Polymeraes使用说明配置：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5 μL、2 mmol/L dNTPs 5 μL、25 mmol/L MgSO43 μL、上下游引物各1 μL、模板（Flag-RIG-I[7]）1 μL、灭菌蒸馏水33 μL。反应程序为94℃预变性2 min；98℃变性10 s，55℃退火30 s，68℃延伸2 min，30个循环；72℃延伸10 min。产物通过琼脂糖凝胶电泳分离回收大小为2.8 kb左右条带，并进行纯化。将得到的RIG-I片段经Xba I/EcoR I酶切后，连入PiggyBac513B-1载体，转化TOP10感受态细胞。取200 μL细胞转化菌液涂布于含100 mg/L 氨苄青霉素的LB平板上，37℃孵育过夜，挑取单菌落扩大培养。采用菌液PCR，琼脂糖凝胶电泳筛选阳性克隆，命名为PR-RIG-I，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.6 CEF的制备取10日龄SPF鸡胚，用碘酒和酒精棉球消毒蛋壳，无菌操作下打开气室，去壳后掀开壳膜，取出胚体放入平皿中，用无血清DMEM培养基清洗1遍，去除头、尾、四肢、骨头、内脏。将胚体放于小烧杯中，用剪刀剪碎，1000×g离心3～5 min，弃上清；用3～5倍细胞体积的浓度为0.25%的胰酶悬浮，放置15 mL离心管中，颠倒数次，至形成云雾状；用含10%血清的DMEM培养基终止消化，1000×g离心3～5 min，弃上清，下层细胞加入一定量的含10%血清的DMEM培养基，用力吹打后待其沉淀，吸取上清加到漏斗中进行过滤；将滤液分装在75 cm2细胞瓶中（根据细胞数量而定），置37℃培养。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.7 表达RIG-I的DF-1的构建将长满单层的DF-1细胞1.5×105个/mL接种于6孔板中，用含10% FBS的DMEM培养基在细胞培养箱中培养，待细胞长满至约80%时共转染PR-RIG-I及PiggyBac系统辅助质粒PB200PA-1，转染24 h后更换药物培养基压力筛选，每3 d更换培养基，持续筛选7 d。7 d后以CEF为饲养细胞进行亚克隆，以PiggyBac系统自带的绿色荧光作为鉴定依据，挑取阳性株进行第二次亚克隆。第二次亚克隆后的阳性株扩大培养，持续传代，收集第1、5、10、15、20、30代细胞，进行后续鉴定。两次亚克隆后，以相同转染方法转染空载体，药物筛选后扩大培养，收集细胞，作为后续鉴定的对照组。

1.8 RT-PCR鉴定加1 mL Trizol到细胞样品中，重悬细胞，室温放置10 min；加入200 μL氯仿，震荡混匀，室温静置15 min；4℃、12 000×g离心10 min，将上清转移至无RNase的离心管中；加入等体积的异丙醇沉淀RNA，-20℃放置20 min，4℃、12 000×g离心10 min，弃去上清；加1 mL70%乙醇洗涤沉淀，4℃、12 000×g离心5 min，去除上清；吹干后加入无RNase水溶解RNA，并测定浓度。反转录参照Promega公司Reverse Transcription System方法进行，最终获得cDNA。以获得的cDNA为模板，利用3对特异性引物进行PCR鉴定。

1.9 Western blot鉴定加200 μL含PMSF的细胞裂解液到细胞样品中，用枪头反复吹打细胞数次，冰上静置10 min后超声破碎，4℃、12 000×g离心5 min，取上清，按比例加入5×上样缓冲液，沸水中煮沸10 min，室温12 000×g离心5 min，进行SDS-PAGE电泳，80V恒压电泳，样品进入分离胶时将电压调至120V，电泳后将凝胶取出，65V恒压电转印2 h。转印好的纤维素膜置于TBST（含0.05% Tween-20的TBS）中漂洗3次，每次3～5 min，然后置于含10%脱脂乳的TBST中4℃封闭过夜，TBST漂洗3次，每次6～8 min。加入适量稀释的多抗血清，37℃作用2 h，TBST漂洗3次。加入辣根过氧化物酶标羊抗鼠二抗（1: 8000稀释），作用2 h，以TBST漂洗3次，每次6～8 min，以ECL增强显色试剂盒显色。完成后，将NC膜浸入Stripping Buffer中，55℃温育30 min，期间缓慢振荡几次，PBST漂洗3次，每次3～5 min。置于10%脱脂乳的PBST中4℃封闭过夜，以鼠源β-actin抗体为一抗（1:1000稀释）和HRP标记羊抗鼠二抗（1:8000稀释），Western blot分析actin蛋白，ECL增强试剂盒显色。

1.10 免疫荧光鉴定将5×105个细胞接种至已事先放置好灭菌飞片的35 mm细胞培养皿中，用含10% FBS的DMEM培养基在37℃、5% CO2细胞培养箱中培养至细胞浓度约70%。去掉培养基，PBS洗涤2次，加入4%中性甲醛室温固定20 min，再用PBS洗涤细胞3次。在湿润的滤纸上覆盖保鲜膜，保鲜膜上滴加100 μL以TBS稀释1000倍的RIG-I多克隆抗体，将含有细胞的飞片扣上，使飞片上的细胞与多抗完全接触，37℃孵育1 h。取出飞片，TBS洗涤3次，取出飞片，TBS洗涤3次，避光，在保鲜膜上滴加100 μL以TBS稀释200倍的羊抗鼠荧光二抗，再将含有细胞的飞片扣上，使飞片上的细胞与多抗完全接触，37℃避光孵育1 h。避光，在保鲜膜上滴加100 μL的以TBS稀释成1: 500的DAPI，再将含有细胞的飞片扣上，使飞片上的细胞与DAPI完全接触，37℃避光孵育1 h。取出飞片，TBS洗涤3次，在载玻片上滴加封片剂，将含有细胞的飞片扣上，用荧光显微镜观察、拍摄。

2 结果

2.1 DF-1细胞对嘌呤霉素敏感性实验根据已报道的文章，选取嘌呤霉素浓度1～10 μg/mL做DF-1细胞敏感性实验。当药物浓度为3 μg/mL时，一直有零星细胞存活，而药物浓度为4 μg/mL，d 4时细胞已全部死亡（图1），因此选取4 μg/mL作为筛选浓度。

图1 不同浓度嘌呤霉素对DF-1细胞致死率曲线图Fig.1 Survival rate of DF-1 cells treated with different doses of puromycin

2.2 PiggyBac-RIG-I质粒的构建及鉴定以本实验室构建、保存的质粒Flag-RIG-I模板对鹅源RIG-I进行PCR扩增（图2），所得目的基因经双酶切后与PiggyBac载体连接，转化后挑取菌斑进行PCR鉴定，PCR鉴定的正确结果送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果正确，可用于后续试验。

图2 PB-RIG-I质粒的PCR鉴定Fig.2 Identifi cation of PB-RIG-I by PCR

2.3 细胞系荧光鉴定PiggyBac载体自带绿色荧光蛋白GFP，转染细胞后在荧光显微镜下观察转染效果（图3B）。由于PiggyBac系统为双启动子系统，因此插入外源片段不会影响GFP蛋白的定位，转染PBRIG-I的DF-1荧光形态与转染空载体的一致（图3C），转染后的细胞进行药物筛选、扩大培养和亚克隆，每次亚克隆以免疫荧光作为鉴定依据，进行后续试验（图3D）。

2.4 细胞系RT-PCR鉴定为了检验鹅RIG-I的细胞系的稳定性，我们将二次亚克隆获得的阳性细胞株进行连续传代，利用RT-PCR对传代细胞进行阳性鉴定。PiggyBac系统为双启动子，目的基因和下游的GFP、抗性基因分属不同启动子，为防止所得单细胞株为空载体细胞株，设计了3对RT-PCR鉴定引物，第1对和第2对分别为针对RIG-I基因（图4A）、GFP基因（图4B）进行鉴定，第3对上游为RIG-I序列，下游为GFP引物，鉴定区间包含RIG-I及GFP（图4C）。结果显示：第1、5、10、15、20、30代细胞株均有RIG-I和GFP的稳定表达，说明RIG-I已在DF-1细胞中稳定表达，而空载体转染组仅有GFP的表达。

图3 PB-RIG-I转染DF-1细胞荧光鉴定Fig.3 Fluorescence of DF-1 cells transfected with PB-RIG-I

2.5 细胞系Western Blot鉴定为了鉴定细胞系中RIG-I蛋白水平的表达情况，我们用本实验室制备的鹅RIG-I多克隆抗体进行Western blot鉴定（图5）。结果显示：第1、5、10、15、20、30代细胞均有RIG-I的稳定表达。

2.6 细胞系免疫荧光鉴定分别将细胞系的第1、5、10、15、20、30代置于含有飞片的35 mm培养皿中，待细胞长满至约70%时取出细胞，中性甲醛固定，一抗二抗孵育后，DAPI染色细胞核，使用封片剂封片后，在荧光显微镜下观察、拍摄。结果如图6所示，每组图片分别为细胞核DAPI染色、红色二抗以及合并结果，其中A组为第1代，B组为第5代，C组为第10代、D组为第15代、E组为第20代、F组为第30代。从结果可以看出，每组中每个细胞都可见红色荧光，证明了细胞系能稳定表达RIG-I。

图4 RT-PCR鉴定表达鹅RIG-I的DF-1细胞系的稳定性Fig.4 Stability identifi cation of DF-1 cells eqpressing goose RIG-I by RT-PCR

3 讨论

虽然发现较晚，但RIG-I作为先天性免疫中的重要组成成分，越来越受到研究人员的重视，对其进行的研究也在不断深入[7,8]。Megan等[9]用禽流感病毒感染雏鸭，发现RIG-I的表达水平显著提高，这也证实主要由RIG-I负责识别流感病毒。将鸭源RIG-I基因瞬时转染到鸡胚成纤维细胞系DF-1中，发现其可以诱导干扰素的表达。分别用禽流感强（H5N1）弱（H5N2）毒株感染转染RIG-I后的细胞，可引起干扰素下游基因表达的上调，病毒滴度也明显降低[3]。孙英杰等[10]鉴定出鹅源RIG-I基因，用RIG-I转染DF-1细胞后感染NDV，发现可引起强烈的抗病毒反应，病毒滴度也明显下降。用NDV感染鹅胚成纤维细胞，也会引起RIG-I表达量的上调。

图5 Western blot鉴定表达鹅RIG-I的DF-1细胞系的稳定性Fig.5 Western blot identifi cation of DF-1 cells with stable expressed goose RIG-I

图6 免疫荧光鉴定表达鹅RIG-I的PF-1系的稳定性Fig.6 Stability identifi cation of DF-1 cells expressing goose RIG-I by immunofl uorescence

RIG-I的天然缺失是否对鸡造成了不利影响，鸡对某些病毒的易感与RIG-I的缺失有没有关系，是目前研究人员的兴趣点，也是争论点。一方面有研究人员认为RIG-I基因的缺失导致鸡易感禽流感，而另一方面研究人员认为同是RIG-I样受体家族的黑色素瘤分化相关基因5（melanoma differentiation associated gene 5，MDA5）会弥补RIG-I的作用，两种观点都有实验依据[11,12]，目前仍无法达成共识，需要进一步的研究。

目前关于禽类RIG-I的研究较少，一方面集中在病毒感染鸭或鹅后，检测组织器官中RIG-I的表达量及病毒滴度，另一方面是病毒感染鸭或鹅原代细胞，或者是将鸭或鹅的RIG-I基因瞬时转染入鸡传代细胞后感染病毒，检测干扰素表达量和病毒滴度。但病毒感染动物，仅能说明RIG-I在鸭和鹅中是否有抗病毒作用，而瞬时转染存在诸多限制：例如转染步骤的繁琐、转染量不一致或转染本身对实验结果的影响等[13,14]。本试验利用PiggyBac转座系统构建的稳定表达鹅源RIG-I的细胞系，将RIG-I基因整合到基因组中，一定程度上缩小了与自然情况的差异，同时也省去了每次试验时的转染步骤，为后续的研究奠定了基础。

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CONSTRUCTION OF CHICKEN EMBRYO FIBROBLAST CELL LINE DF-1 STABLY EXPRESSING GOOSE RIG-I THROUGH PIGGYBAC TRANSPOSON SYSTEM

HU Yue1, SUN Ying-jie2, WANG Xiao-xu3, QIU Xu-sheng2, SONG Cui-ping2, TAN-Lei2, HU Gui-xue1, DING Chan2
(1. College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 3. College of Animal Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 223006, China)

Retinoic acid inducible gene-I (RIG-I) is a family member of cytoplasmic pattern recognition receptors (PRRs), which acts as a sensor for RNA virus and plays an important role in antiviral innate immunity. RIG-I is evolutionally conserved among most species. However, several reports and our previous studies have identifi ed that receptors for RIG-I exist in both ducks and geese, but not in chickens. To investigate whether this natural loss of RIG-I plays a negative role in chicken, goose RIG-I was transfected into chicken embryo fi broblast cell line DF-1 through PiggyBac transposon system. Monoclonal cells were obtained from twice sub-cloned cultures. DF-1 cells stably expressing goose RIG-I were identifi ed by detection of fl uorescence, RT-PCR and Western blot. The present study has laid the foundation for future research on mechanism of chicken innate immunity and function of goose RIG-I.

Goose retinoic acid inducible gene-I(RIG-I); chicken embryo fi broblast cell line DF-1; Piggy-Bac transposon system

S852.42

A

1674-6422（2014）03-0053-08

2014-02-14

863计划（2011AA10A209）；国家自然科学基金项目（31101822）；中央级公益性科研院所基本科研业务费（2014JB08）

胡跃，男，硕士研究生，预防兽医学专业

丁铲，E-mail：shoveldeen@shvri.ac.cn；胡桂学，E-mail：huguixue901103@163.com