Stathmin基因在Ⅱ期非小细胞肺癌中表达的意义

王小红 周星明 江洪 张谷 苏丹

●论 著

Stathmin基因在Ⅱ期非小细胞肺癌中表达的意义

王小红 周星明 江洪 张谷 苏丹

目的 探讨Ⅱ期非小细胞肺癌（NSCLC）中Stathmin mRNA和蛋白表达水平与患者预后的关系。方法单基因定量法检测已手术Ⅱ期NSCLC患者肿瘤组织中Stathmin mRNA表达；免疫组化法检测患者肿瘤组织中Stathmin蛋白表达水平。所有患者行长春瑞滨联合顺铂方案化疗，统计学分析其表达水平与患者临床病理学特征之间的关系，并随访患者的无瘤生存时间（DFS）和总体生存时间（OS），统计学分析StathminmRNA和蛋白表达水平与患者的DFS、OS的关系。结果Stathmin mRNA表达水平与患者的T、N分期显著相关，与患者的年龄，病理类型均无显著相关性；Stathmin蛋白表达水平与患者的年龄、病理类型、T、N分期均无显著相关性；Stathmin mRNA和蛋白表达水平与患者的OS，DFS均无显著相关性。结论Ⅱ期NSCLC患者肿瘤组织中Stathmin表达水平不能作为预测患者预后的指标。

肺肿瘤 Stathmin

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤，在恶性肿瘤相关死亡原因中占第一位。非小细胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌病例的80%，5年生存率不足15%。近年研究表明，细胞信号转导中相关因子的表达异常、肿瘤细胞DNA修复的异常与肺癌的发生、发展存在密切联系。因此，我们用单基因定量法检测了73例已手术Ⅱ期NSCLC患者肿瘤组织中Stathmin mRNA表达，免疫组化法检测患者肿瘤组织中Stathmin蛋白表达，评价其表达水平与患者临床病理学特征之间的关系，同时随访患者的无瘤生存时间（DFS）和总体生存时间（OS），统计分析Stathmin mRNA和蛋白表达水平与患者DFS、OS的关系。我们试图探索Stathmin在肺癌发生、发展过程中起到的作用，并研究Stathmin基因表达水平与患者预后的关系。

1 资料和方法

1.1 一般资料 所有标本均从本院标本库中筛选（患者均签定知情同意书，医院伦理委员会讨论通过）。术后病理按照2006年国际抗癌联盟（UICC）TNM分期标准进行分期，共筛选2007-09—2010-06经根治性手术切除的Ⅱ期NSCLC患者73例。其中男58例，女15例；年龄≤60岁55例，＞60岁18例；肿瘤大小≤3cm 22例，＞3cm 51例；无淋巴结转移28例、有淋巴结转移45例；高-中分化53例、低分化20例；腺癌33例、鳞癌36例、其他病理类型4例。

1.2 辅助化疗 患者术后转至化疗科行长春瑞滨联合顺铂化疗，顺铂75mg/m2分3d给予，长春瑞滨25mg/m2第1、8天，以上方案每3周重复。其中1例患者因骨转移只进行2周期化疗，有4例患者第1周期化疗在本院进行，余3个周期化疗在当地进行，其余患者均在本院完成4个周期的化疗。

1.3 随访资料（DFS和3年生存率） 73例患者，70例通过电话随访，其中失访3例，由指定医师完成，每3个月1次。随访率为95.89%，失访病例按截尾值处理。

1.4 mRNA检测 用单基因定量（Quanti-Gene Assay）方法进行，由基因科技（上海）有限公司完成。步骤如下：先将3～5片的石蜡切片样本直接用200μl裂解液裂解完全消化后，室温12 000r/min，离心半径9cm，离心取上清液，与反应系统的各试剂包括微珠和探针等混合，在54℃600r/min的条件下过夜混合杂交，杂交后利用磁力洗去未杂交到微珠上的杂质。接着对捕捉到的RNA信号利用bDNA技术做级联放大，通过预放大，放大，标记探针在50℃600r/min的条件下分别作1h杂交，每一步杂交后都需要用洗涤液洗3次。最后做SAPE标记后利用Luminex 200读取基因表达数据。检测过程按文献[1]的方法进行。检测Stathmin mRNA的寡核苷酸探针QuantiGene 2.0工具由Panomics公司设计并合成。HPRT1基因作为质量控制基因,每个样本均检测待检基因和HPRT1基因拷贝数。

1.5 Stathmin蛋白水平检测 采用免疫组化方法，由本院病理科完成，免疫组化试剂购自福州迈新公司。Stathmin蛋白主要表达在细胞质中，阳性呈棕黄色，以内皮细胞作阳性对照。结果判断采用半定量法，即结合阳性细胞的染色强度和百分比来判定表达状态。染色强度：无色0分、浅黄色1分、棕黄色2分、棕褐色3分。着色细胞比例：无着色0分、＜5%为1分、6%～30%为2分、31%～60%为3分、≥61%为4分。两者相加得分为判定级别：≤2分为阴性，＞2分为阳性。

1.6 统计学处理 应用SPSS17.0软件完成，采用COX模型进行单因素分析，Kaplan-Meier法绘制生存曲线，并经Log-rank检验。

2 结果

2.1 癌组织中Stathmin mRNA的表达 均值0.916739，中位值0.6318，极小值0.335，极大值5.0746，方差0.975。

2.2 癌组织中Stathmin蛋白表达 在73例患者中，Sthatmin阴性45例，阳性28例，阳性率为38.4%，见图1、2。

图1 Sthatmin高表达

图2 Sthatmin低表达

2.3 Stathmin表达水平与患者临床病理学特征之间的关系 Stathmin mRNA表达水平与患者的T、N分期显著相关，与患者的年龄、病理类型均无显著相关性；Stathmin蛋白表达水平与患者的年龄、病理类型、T、N分期均无显著相关性，见表1。2.4 随访结果 70例患者中19例在随访期间死亡，3年生存率为为75.1%，5年生存率为56.6%，中位生存时间68个月（95%CI：45.21～90.79），见图3。

表1 Stathmin表达水平与患者临床病理学特征之间的关系（例）

图3 70例患者的生存曲线图

2.5 不同Stathmin表达患者OS、DFS的比较 Stathmin mRNA低表达患者OS、DFS与高表达患者相比，均无统计学差异，见图4、5。

图4 不同Stathmin表达患者的DFS曲线图（χ2=0.227，P=0.633）

图5 不同Stathmin表达患者的OS曲线图（χ2=1.907，P=0.167）

2.6 Sthatmin蛋白表达水平与患者预后的关系 Sthatmin阴性者44例，阳性者26例，两组患者的OS、DFS比较，差异意义均无统计学，见图6、7。

图6 不同Stathmin蛋白表达水平患者的DFS曲线图（χ2=0.229，P=0.633）

图7 不同Stathmin蛋白表达水平患者的OS曲线图（χ2=2.365，P=0.124）

3 讨论

Stathmin是一种重要的微管解聚蛋白，作为细胞信号转导分子在细胞分化、组织再生与修复、尤其在恶性肿瘤的发生、发展及表型决定上有重要作用及意义。在细胞周期的不同阶段通过磷酸化和去磷酸化作用，对细胞微管系统动力平衡的调节发挥十分重要的作用。虽然没有直接的证据表明Stathmin高表达与恶性肿瘤的转化直接相关,但有证据提示肿瘤细胞高增殖率与它直接相关。Singer等[2]发现，在NSCLC中，无论腺癌还是鳞癌细胞中均可观察到Stathmin及其家族成员Stathminlike 3（SCLIP）高表达而引起的肿瘤细胞分裂增殖加快和基质浸润、细胞迁移运动增加的现象。也有学者证明Stathmin基因表达水平与肺癌的分化程度成反比，即Stathmin基因表达水平越高，肺癌分化程度越低。同时，他们还认为Stathmin基因高表达可以作为诊断肺癌的肿瘤标志物。我们的研究也提示Stathmin mRNA表达水平与肺癌的肿瘤大小，淋巴结转移等多种临床病理学特征有关，但以上的研究证据均是在中晚期肺癌中获得的。Stathmin基因在肺癌尤其是早期肺癌发生、发展过程中的作用，尚待进一步研究证实。

目前的研究表明Stathmin在多种恶性肿瘤中表达升高，且其表达水平与肿瘤恶性度和预后密切相关，可能成为新的治疗靶点。在口腔鳞状细胞癌中和消化系统肿瘤中，显著升高的Stathmin水平与肿瘤的TNM分期、分化程度及预后密切相关[3-4]。在乳腺癌、子宫内膜癌和卵巢癌中的研究表明，Stathmin表达有独立的预后价值，且Stathmin高表达的卵巢癌患者使用紫杉醇和铂类化疗预后不良。这一发现支持Stathmin可能会干扰紫杉醇治疗，导致预后不良[5-6]。

肺癌中目前未有明确证据证实Stathmin表达与患者预后有关。蒲骁麟等[7]报道，在晚期NSCLC中，免疫组织化学方法测得的Stathmin表达水平与长春瑞滨+顺铂/卡铂（NP）方案的化疗疗效负相关，且可能与患者的预后负相关。但我们的研究结果表明：Ⅱ期NSCLC术后标本中Stathmin mRNA和蛋白表达均与患者预后无关，不能作为患者预后的独立预测指标。其高表达患者与低表达患者相比，DFS和OS均无统计学差异。

为什么会出现上述不一致的结果呢？这种不同结果的解释可能是：（1）是否Stathmin的表达在不同期别的NSCLC存在着不同的预测结果?我们的研究结果也提示患者的T、N分期级别越高，Stathmin mRNA的表达水平越高。（2）检测的病例、样本和标准的不同。目前的研究多为晚期病例，且多采用穿刺或纤支镜标本，组织样本量较少，而我们的检测对象为Ⅱ期NSCLC的术后标本，样本含量大。（3）样本例数的限制。（4）随访时间的长短可能都是造成结果不同的原因。这也反映了Stathmin的表达对肺癌患者预后的预测价值不如对乳腺癌、卵巢癌和消化系统恶性肿瘤，仍需大样本前瞻性试验的证实[8]。因此，我们正在不断积累样本例数，并且尝试使用更多的方法来检测更多不同期别的肺癌标本中微管基因的表达水平，以期获得更加准确的结果。

[1]Eastham L L,Mills C N,Niles R M.PPARalpha/gamma expression and activity in mouseand human melanocytes and melanoma cells[J].Pharm Res,2008,25(6)：1327-1333.

[2]Singer S,Malz M,Herpel E,et al.Coordinated expression of Stathmin family members by far upstream sequence element-binding protein-1 increases motility in non-small cell lung cancer[J]. Cancer Res,2009,69(6)：2234-2243.

[3]Jeon T Y,Han M E,Lee Y W,et al.Overexpression of Stathmin1 in the diffuse type of gastric cancer and its roles in proliferation and migration of gastric cancer cells［J].Br J Cancer,2010,102：710-718.

[4]Gan L,Guo K,Li Y,et al.Up-regulated expression of Stathmin may be associated with hepatocarcinogenesis[J].Oncol Rep, 2010,23：1037-1043．

[5]Su D,Smith S M,Preti M,et al.Stathmin and tubulin expression and survival of ovarian cancer patients receiving platinum Treatment with and without paclitaxel[J].Cancer,2009,115(11)：2453-2463．

[6]McGrogan B T,Gilmartin B,Carney D N,et al.Taxanes,microtubules and chemoresistant breast cancer[J].Biochim Biophys Acta,2008,1785(2)：96-1321.

[7]蒲骁麟,王峻,许林,等.β-tubulin-Ⅲ和Stathmin与晚期NSCLC化疗敏感性的关系[J].中国肺癌杂志,2009,12(1)：49-53.

[8]Stengel C,Newman S P,Leese M P,et al.Class III beta-tubulin expression and in vitroresistance to microtubule targeting agents[J]. Br JCancer,2010,102(2)：316-324．

（本文编辑：田云鹏）

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本刊编辑部

Expression of Stathmin in stage II non-small cell lung cancer and its significance

Objective To investigate the expression of Stathmin in stageⅡnon-small cell lung cancer(NSCLC)and its significance.MethodsThe expression of Stathmin mRNA and protein was detected by Quanti-Gene Assay and immunohistochemistry,respectively.All patients received NP chemotherapy.The patients were followed-up;the disease-free survival(DFS) and overall survival(OS)were observed.The correlation of Stathmin expression level with the clinicopathological features of NSCLC and prognosis of patients were analyzed.ResultsStathmin mRNA expression levels was significantly correlated with T stage and N stage.There was no significant correlation of Stathmin mRNA and protein expression levels with the OS and DFS of patients.ConclusionIn patients with stageⅡ NSCLC,the expression levels of Stathmin mRNA and protein in cancer tissue cannot be used as a prognostic indicator.

Lung cancer Stathmin

2013-12-11）

浙江省教育厅资助课题（2007-01345）

310022 杭州，浙江省胸部肿瘤（肺、食管）诊治技术研究重点实验室、浙江省肿瘤医院化疗科（王小红），胸外科（周星明、江洪），病理科（张谷），研究所（苏丹）

江洪，E-mail：hh110120@126.com