p27kip1蛋白在结肠癌组织中的表达及意义

程翅 张海峰 闫康鹏 梁磊

p27kip1蛋白在结肠癌组织中的表达及意义

程翅 张海峰 闫康鹏 梁磊

目的 探讨p27kip1蛋白在结肠癌组织中的表达及意义。方法应用免疫组化方法检测结肠癌组织（观察组40例）及癌旁正常组织（对照组20例）中p27kip1蛋白的表达，比较其阳性表达率，并比较分析观察组不同分化程度及有无淋巴结转移患者p27kip1蛋白的阳性表达程度。结果观察组中p27kip1蛋白阳性表达16例（40．00%），对照组中p27kip1蛋白阳性表达15例（75．00%），差异有统计学意义（P＜0．05）。高、中分化患者p27kip1蛋白的阳性表达程度明显高于低分化患者，差异有统计学意义（P＜0．05）。有淋巴结转移患者p27kip1蛋白的阳性表达程度明显低于无淋巴结转移患者，差异有统计学意义（P＜0．05）。TNM分期Ⅰ～Ⅱ期患者p27kip1蛋白阳性表达12例（63．16%），Ⅲ～Ⅳ期患者p27kip1蛋白阳性表达4例（19．05%），差异有统计学意义（P＜0．05）。结论p27kip1蛋白作为抑癌因子具有调控细胞增殖、分化及凋亡的能力，而组织中p27kip1蛋白的低表达可能导致了肿瘤的发生、发展。p27kip1蛋白可能作为临床上检测结肠癌的新指标，有助于结肠癌的肿瘤分化、肿瘤转移及肿瘤TNM分期的诊断。

p27kip1 结肠癌 结肠肿瘤

目前，结肠癌发病原因尚不清楚，可能与饮食、遗传因素、致癌物质、慢性炎症、癌前病变等因素有关。1994年，Polyak等[1]发现的p27kip1基因位于人12号染色体的12p12～12p13.1交界处，包含2个有编码功能的外显子、1个无功能的外显子和1个内含子，其产物为相对分子质量为27 000的热稳定蛋白，含有198个氨基酸，能与细胞周期依赖激酶和周期素（cyclin）如cyclinF-cdk2、cyclinD-cdk4及cyclinD-cdk6等结合，并发挥其激酶抑制作用。新近研究发现，多种人类肿瘤中存在p27kip1蛋白表达减少或缺失，而p27kip1蛋白水平与恶性肿瘤的生物学行为存在一定的负相关。目前，临床上普遍认为p27kip1基因是一种新的抑癌基因。Harvat等[2]发现，外源性加入纯化的p27kip1蛋白或使内源性p27kip1蛋白释放增加均可导致细胞生长停滞。因此，了解p27kip1蛋白的调节机制对肿瘤的基因治疗及相关肿瘤药物治疗靶点的选择有着重要的临床意义。p27kip1蛋白在胃癌[3]、肝癌[4]等肿瘤中呈低表达现象，其在结肠癌中是否也呈低表达现象呢？本研究旨在探讨结肠癌中p27kip1蛋白的表达情况及意义，以期为结肠癌的治疗提供实验依据。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选取2012-01—2013-07月本院收治的40例结肠癌患者，组织标本均为手术切除标本，病理诊断结肠癌。术前均未行化疗、放疗及其他肿瘤相关治疗。将40例患者的结肠癌组织标本作为观察组，其中男26例，女14例；年龄40～79（66±2）岁；TNM分期（1997年UICC分类分期法）：Ⅰ期11例，Ⅱ期8例，Ⅲ期11例，Ⅳ期10例；高分化癌11例，中分化癌12例，低分化癌17例；淋巴结转移阳性21例，阴性19例。并随机选取20例观察组组织标本的癌旁切缘2cm以上正常结肠组织标本作为对照组，其中男12例，女8例，年龄40～79（64±2）岁。病理检查确定为正常结肠组织。所有组织标本均经10%中性甲醛溶液固定，常规脱水后石蜡包埋，4μm连续切片，分别用于免疫组化染色。

1.2 主要试剂 鼠抗人p27kip1单克隆抗体（北京中衫金桥生物有限公司国际代理；SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY，INC），二步法免疫组化检测试剂PV-9000（北京中衫金桥生物有限公司）；DAB显色试剂盒（北京中衫金桥生物有限公司）。

1.3 免疫组化方法 严格按照标准免疫组化染色操作步骤进行。免疫组化染色对照：p27kip1蛋白用已知结肠癌的阳性片作为阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。1.4 结果判定 所有切片采用双盲法由2位病理科专家独立阅片。p27kip1蛋白阳性主要为细胞质出现棕黄色，细胞核也可见表达。随机观察10个高倍视野（×400）并计数，每个视野至少计数100个细胞，取其平均值计算细胞阳性率，并据此对染色结果分级。参照文献[5]：p27kip1蛋白阳性率＜10%为阴性（-），10%～50%为弱阳性（+），≥50%为强阳性（++）。

1.5 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件，率的比较采用χ2检验，等级资料的比较采用Ridit分析。

2 结果

2.1 p27kip1蛋白阳性表达情况 见图1-2。

图1 正常结肠组织中p27kip1蛋白表达强阳性（a：SP× 200；b：SP×400）

图2 结肠癌组织中p27kip1蛋白表达阳性（a：SP×200；b：SP×400）

2.2 两组标本组织中p27kip1蛋白阳性表达率的比较 观察组中阳性表达16例（40.00%），阴性表达24例（60.00%）；对照组中阳性表达15例（75.00%），阴性表达5例（25.00%）。观察组中p27kip1蛋白阳性表达率明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 观察组不同分化程度患者p27kip1蛋白表达的比较 见表1。

表1 观察组不同分化程度患者p27kip1蛋白表达的比较（例）

由表1可见，高、中分化患者p27kip1蛋白的阳性表达程度明显高于低分化患者，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。

2.4 观察组淋巴结转移与未转移患者p27kip1蛋白表达的比较 见表2。

表2 观察组淋巴结转移与无转移患者p27kip1蛋白表达的比较（例）

由表2可见，有淋巴结转移患者p27kip1蛋白的阳性表达程度明显低于无淋巴结转移患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.5 观察组不同TNM分期患者p27kip1蛋白阳性表达率的比较 见表3。

由表3可见，TNM分期Ⅰ～Ⅱ期患者p27kip1蛋白阳性表达率明显高于Ⅲ～Ⅳ期，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 观察组不同TNM分期患者p27kip1蛋白阳性表达率的比较[例（%）]

3 讨论

目前，国内外尚无文献报道p27kip1蛋白在结肠癌细胞中的表达定位。Fan等[6]应用免疫组化法检测109例喉鳞状细胞癌组织中p27kip1蛋白的表达水平时发现，p27kip1蛋白主要定位于细胞核，偶见胞质或胞质与胞核同时表达。本研究结果显示，p27kip1蛋白阳性表达主要定位于胞质，胞核仅少部分表达，偶见胞质与胞核同时表达，与Fan等的研究结果不符，提示p27kip1蛋白在不同细胞中的表达位置有所不同，其具体原因有待进一步研究。

p27kip1蛋白亦参与细胞的诱导分化和凋亡，p27kip1蛋白水平的降低使得细胞凋亡减少也可能是促进肿瘤的发生、发展的机制。Florenes等[7]及Kuo等[8]在皮肤癌和口腔癌中同样发现p27kip1蛋白的低表达水平。Sui等[9]采用免疫组化法观察22例卵巢上皮性良性肿瘤、23例卵巢上皮性交界性肿瘤、34例卵巢上皮性恶性肿瘤中的p27kip1蛋白表达与组织学分级发现，p27kip1蛋白与肿瘤恶性程度呈负相关，提示低p27kip1蛋白促进卵巢上皮性肿瘤的发展。本研究结果发现，p27kip1蛋白在结肠癌组织的阳性表达率显著低于在癌旁正常结肠中的阳性表达率，提示p27kip1蛋白表达的降低可能促进结肠癌的发生、发展；p27kip1在高分化型结肠癌组织表达量最强，在低分化型结肠癌组织中表达量最弱，提示p27kip1蛋白水平的高低可能与结肠癌的细胞分化程度有关。

新近研究表明，p27kip1蛋白可增强细胞间的黏附作用，促进钙粘素的丛集，而钙粘素具有介导细胞间和细胞与基质间的黏附作用；同时，p27kip1蛋白可阻止正常细胞与基质结合[10]。而调节p27kip1蛋白表达的信号可能通过改变细胞形状或改变细胞接受胞外信号的能力而达到调节细胞间的黏附作用。本研究结果显示，观察组中有淋巴结转移患者p27kip1蛋白的表达量低于无淋巴结转移组患者，表明p27kip1蛋白可能与结肠癌的侵袭转移有关。p27kip1蛋白的表达水平在结肠癌不同临床分期上的研究国内外尚无相关报道。而在临床上，结肠癌早期和晚期的治疗方法和治疗效果都相差较大，因此临床上对结肠癌早期和晚期的诊断尤为重要。本研究发现，p27kip1蛋白在TNM分期Ⅰ～Ⅱ期（早期）中的表达量高于Ⅲ～Ⅳ期（晚期）中的表达量，表明p27kip1蛋白的表达水平可能与肿瘤的分期有关，肿瘤早期p27kip1蛋白尚有明显表达，而肿瘤晚期p27kip1蛋白则表达不明显。因此，p27kip1蛋白有可能作为一种临床诊断结肠癌早期和晚期的新指标，有待进一步研究。本实验采用免疫组化法通过对40例结肠癌组织和20例癌旁正常结肠组织的检测，实验结果与假设相一致，证实了p27kip1蛋白在结肠癌中的低表达，可能与结肠癌的细胞分化程度、转移和肿瘤临床分期有关。

综上所述，p27kip1蛋白在结肠癌中的低表达，可能与结肠癌的细胞分化程度、转移和肿瘤临床分期有关。深入探讨p27kip1蛋白在结肠癌发生、发展中的作用，将有助于进一步了解结肠癌的发生机制，从而为结肠癌的治疗提供一定的实验依据，p27kip1蛋白也将成为结肠癌试验性基因治疗的靶点。

[1]Polyak,Kato J Y,Solomon M T,et al．P27kip1,a cyclin-CDK inhibitor,links transforming growth factorbeta and contact inhibition to cell cyclin arrest[J]．Genes Dev,1994,8(1)：9．

[2]Harvat B L,Seth P,Jetten A M．The role of p27kip1 in gamma interferon-mediated growth arrest of mammary epithelial cells and related defects in mammary carcinnoma cells[J]．Oncogene, 1997,14(17)：2111．

[3]Mori M,Mimori K,Shiraishi T,et al．P27 expression and gastric carcinoma[J]．Nat Med,1997,3(6)：593．

[4]Ito Y,Matsuura N,Sakom M,et al．Clinical outcomes after hepatitis C infection from contaminated anti-D immuneglobulin[J]．Heptology,1999,30(1)：90．

[5]Tamura N,Dong Y,Sui L,et al．Cyclin-dependent kinase inhibitor p27 is related to cell proliferation and prognosis in laryngeal squamous cell carcinomas[J]．J Laryngol Otol,2001,115(5)：400-406．

[6]Fan G K,Fujieda S,Sunaga H,et al．Expression of protein p27 is associated with progression and prognosis in laryngeal cancer [J]．Laryngoscope,1999,109(5)：815．

[7]Florenes V A,Maelandsmo G M,Kerbel R S,et al．Protein Expression of the cell-cycle inhibitor p27kip1 in Melanoma：inverse correlation with disease-free survival[J]．Am J Pathol,1998,153 (1)：305-312．

[8]Kuo M Y,Hsu H Y,Kok S H,et al．Prognostic role of p27 kip expression in oral squamous cell carcinoma in Taiwan[J]．Oroal On-col,2002,38(2)：172．

[9]Sui L,Dong Y,Ohno M,et al．JAB1 expression is associated with inverse expression of p27kip1 and poor prognosis in epithelial ovarian tumors[J]．Clin Cancer Res,2001,7(12)：4130-4135．

[10]Supriatno,Harada K,Kawaguchi S,et al．Effect of p27kip1 on the ability of invasion and metastasis of an oral cancer cell line [J]．Oncol Rep,2003,10(3)：527-532．

Empirical study of expression of p27kip1 proteins in carcinoma of colon

Objective To study the express of p27kip1 in carcinoma of colon，then to investigate its roles and probable mechanism in the pathogenesis of colon cancer．MethodsImmunohistochemistry was used to detect the expression and distribution of p27kip1 in carcinoma of colon and normal colon．Statistics was used to analyze the data．Making a analysis of positive expression level of p27kip1 protein in colon caner tissue with different degree of differentiation and lymph node metastasis．Results16 cases of positive expression of p27kip1 Protein in observation group(40%),15 cases of positive expression of p27kip1 Protein in the control group(75%),the difference was statistically significant(P＜0．05)．The expression of p27kip1 Protein in group of high degree of differentiation was significantly higher than that group of low differentiated．The difference was statistically significant(P＜0．05)．The positive expression of p27kip1 Protein in patients with the extent of lymph node metastasis was significantly lower than that in patients without lymph node metastasis,the difference was statistically significant(P＜0．05)．12 cases of positive expression of p27kip1 Protein in TNM stage I～II(63．16%),4 cases of positive expression of p27kip1 Protein in TNM stageⅢ～Ⅳ(19．05%),the difference was statistically significant(P＜0．05)．Conclusionp27kip1 protein as a tumor suppressor factor that can regulate cell proliferation,differentiation and apoptosis of ability．Low expression of p27kip1 protein led to tumor occurrence and development in organization．Protein of p27kip1 would be considered as new clinical index of colon carcinoma,and make for diagnose of neoplasm differentiation,neoplasm metastasis and TNM staging．

p27kip1 Colon cancerImmunohistochemical

2013-07-26）

（本文编辑：欧阳卿）

325200 温州医科大学附属第三医院普外二科

张海峰，E-mail：15825618600@163.com