透明质酸钠对大鼠脊髓损伤后膀胱黏膜修复的影响

诸靖宇 王彦彬 宋晨 楼扬锋

透明质酸钠对大鼠脊髓损伤后膀胱黏膜修复的影响

诸靖宇 王彦彬 宋晨 楼扬锋

目的 探讨透明质酸钠对大鼠脊髓损伤后膀胱黏膜修复的影响。方法将48只大鼠随机分为正常对照组、模型对照组及透明质酸钠灌注组，每组16只。采用脊髓横断法建立大鼠脊髓损伤的神经源性膀胱模型。通过观察各组大鼠膀胱大体情况、HE染色情况、组织学损伤评分以及膀胱组织中IL-6的表达情况评估其炎症的严重程度。结果正常对照组膀胱组织无明显病理改变；模型对照组膀胱组织可见大量中性粒细胞浸润，黏膜严重充血、出血，上皮细胞坏死，黏膜、黏膜下层及肌层均有炎性水肿；透明质酸钠灌注组膀胱组织可见黏膜充血，少量炎性细胞浸润。模型对照组及透明质酸钠灌注组组织学损伤评分及膀胱组织中IL-6阳性表达率均显著高于正常对照组，透明质酸钠灌注组组织学损伤评分及膀胱组织中IL-6阳性表达率明显低于模型对照组，差异均有统计学意义（P＜0．05或0．01）。结论透明质酸钠膀胱灌注可以减轻大鼠脊髓损伤后膀胱黏膜急性炎症反应以及促进损伤后的膀胱黏膜修复。

透明质酸钠 脊髓损伤 神经源膀胱 膀胱黏膜 修复

神经源性膀胱是泌尿外科常见疾病，治疗尤为困难，目前尚缺乏一种积极有效的手段来主动保护黏膜。尽管目前关于透明质酸钠修复膀胱黏膜的报道已有较多，但关于透明质酸钠对脊髓损伤后膀胱黏膜修复的影响尚未见报道。为此，本研究采用脊髓横断法建立大鼠脊髓损伤的神经源性膀胱模型，通过外源性补充透明质酸钠，观察透明质酸钠膀胱灌注对减轻膀胱黏膜炎症及促进损伤后膀胱黏膜修复的影响。

1 材料和方法

1.1 材料 SD雌性成年大鼠48只，购自浙江中医药大学实验动物中心。透明质酸钠为杭州协合医疗用品有限公司生产[大分子量（1 650ku），浓度1%，5ml/支]，IL-6兔抗鼠多克隆抗体购于武汉博士德生物工程有限公司，免疫组织化学超敏Ultra Sensitive SP试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2 大鼠急性脊髓损伤模型制作[1]腹腔注射戊巴比妥钠（25～30mg/kg）麻醉，经背部纵行切口，切除T8和T9椎板，然后在脊髓T9节段行全横断术，并切除其上4mm脊髓组织，清除损伤腔内残留的神经组织，在缺损腔内植入约2mm×2mm×4mm的骨腊作为填充物。逐层缝合脊柱切口，1号丝线间断缝合皮肤。造模成功标准：切除脊髓时尾巴痉挛性摆动，双下肢及躯体回缩样扑动。大鼠脊髓损伤后立即处于脊髓休克期，部分在耻骨联合上缘可触及胀大的膀胱。损伤初期采用腹部按压方式辅助排尿。术后前5d每天对造模成功大鼠按压下腹部膀胱区辅助排尿3次，每只大鼠均单笼饲养。术后均连续3d腹腔注射青霉素（50 000U·kg-1·d-1）。

1.3 分组及处理方法 将大鼠随机分为正常对照组、模型对照组及透明质酸钠灌注组，每组16只。所有大鼠均用10%水合氯醛（0.3ml/100g）腹腔内注射法麻醉大鼠，采用3F硬膜外导管经尿道插入大鼠膀胱，妥当固定后连接好1ml注射器。正常对照组仅应用尿道插管，并拔管，2次/周，共4周；模型对照组采用0.9%氯化钠溶液0.5ml注入膀胱，30min后抽出液体，用0.9%氯化钠溶液冲洗4次后拔管，2次/周，共4周；透明质酸钠灌注组采用透明质酸钠液0.5ml注入膀胱，30min后抽出，然后用0.9%氯化钠溶液冲洗4次后拔管，2次/周，共4周。

1.4 标本制作及结果判定 所有大鼠处理4周后24、72h各半数处死，取膀胱标本，观察标本大体情况，固定后行常规石蜡包埋、切片、HE染色，依据Iba等[2]采用的组织学损伤评分标准评分。采用高压锅法修复抗原，免疫组化SP三步法测定大鼠膀胱组织中IL-6的表达情况，DAB显色，苏木精衬染，以胞质、胞核出现棕黄色为阳性，以细胞无棕黄色或与背景一致的浅棕色为阴性，在400倍光镜下观察，随机挑选10个视野，计算阳性细胞和总细胞数，得出阳性细胞率（阳性细胞/总细胞数）。

1.5 统计学处理 采用SPSS15.0统计软件，计量资料以表示，组间比较采用方差分析，组间计数资料的比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 3组大鼠膀胱大体改变的比较 正常对照组大鼠膀胱黏膜无明显改变；模型对照组大鼠膀胱黏膜上皮可见明显溃疡灶，周围黏膜水肿隆起，上皮可见广泛的出血点；透明质酸钠灌注组黏膜上皮有少量脱落，有表浅溃疡灶，周围黏膜轻度水肿，有散在的小出血点。

2.2 HE染色结果及组织学损伤评分 正常对照组无明显病理改变（图1a），组织学损伤评分（0.441±0.138）分；模型对照组可见大量中性粒细胞浸润，黏膜严重充血、出血，上皮细胞坏死，黏膜、黏膜下层及肌层均有炎性水肿（图1b），组织学损伤评分（8.265±0.377）分；透明质酸钠灌注组可见黏膜充血，少量炎性细胞浸润（图1c），组织学损伤评分（5.492±0.241）分。模型对照组及透明质酸钠灌注组组织学损伤评分均显著高于正常对照组，透明质酸钠灌注组组织学损伤评分明显低于模型对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05或0.01）。2.3 3组大鼠膀胱组织免疫组化染色IL-6的表达情况 正常对照组IL-6低表达，着色较浅呈弱阳性（图2a），阳性表达率为（13.8±3.1）%；模型对照组尿路上皮细胞、血管内皮细胞、淋巴细胞及成纤维细胞的胞质中IL-6高表达，阳性表达率（47.2±1.5）%；透明质酸钠灌注组阳性表达率（34.4±3.7）%。模型对照组及透明质酸钠灌注组IL-6阳性表达率均显著高于正常对照组，透明质酸钠灌注组IL-6阳性表达率模型低于模型对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05或0.01）。

3 讨论

脊髓损伤后患者均存在不同程度的膀胱功能障碍，可诱发一系列的泌尿系并发症，如尿路感染、神经源性膀胱、尿失禁，以及更严重的肾积水、肾功能衰竭。而神经源性膀胱的治疗往往从患者脊髓损伤恢复后期才开始，总是在肢体康复之后，此时的膀胱黏膜屏障破坏严重[3-4]，引起尿路感染的因素持续存在，往往需要长期应用抗生素，难以达到最佳疗效，且容易产生耐药菌。

有学者报道认为，尿路上皮表面存在葡萄糖胺基聚糖层，它可以阻止细菌团块、致炎物质、致癌物质等黏附至膀胱黏膜表面，当各种原因使此保护机制受到破坏时，就会导致膀胱黏膜损伤，使得各种损伤因子包括细菌团块、尿液中各种离子等接触到膀胱黏膜下层，进而引起一系列病理变化，包括各种炎症细胞的浸润、间质水肿、细胞增生等[5-6]。葡萄糖胺聚糖（glucosaminoglycam，GAG）的一个基本组成成分是透明质酸，透明质酸钠是透明质酸的钠盐形式，透明质酸钠可以对膀胱上皮细胞的GAG层缺损进行修复，阻止了毒性物质透过渗透性屏障损害肌层。近年来，透明质酸钠膀胱灌注是临床一大热点，国内外有较多文献报道[7-10]，但大都局限于间质性膀胱炎、腺性膀胱炎或放射性膀胱炎等，有关透明质酸钠对大鼠脊髓损伤后膀胱黏膜修复的影响，国内外均未见有报道。

图1 3组大鼠膀胱标本HE染色结果（a：正常对照组；b：模型对照组；c：透明质酸钠灌注组；×100）

图2 3组大鼠膀胱组织免疫组化染色IL-6表达情况（a：正常对照组；b：模型对照组；c：透明质酸钠灌注组；×400）

IL-6是一种具有多向调节功能的细胞因子，参与机体的炎症应答及自身免疫应答过程，在机体多种生理或病理条件下都发挥着重要作用[11]。本研究结果表明，IL-6也可在正常尿路上皮中表达，但阳性较弱；在模型对照组中，大鼠膀胱黏膜尿路上皮细胞及间质中的血管内皮细胞、单核细胞及肥大细胞均有IL-6的较强表达；与模型对照组比较，透明质酸钠灌注组IL-6的表达减少。另外，透明质酸钠灌注组的组织学损伤评分及IL-6的表达均明显低于模型对照组，证明使用透明质酸钠膀胱灌注可以减轻膀胱黏膜的炎症反应或增强膀胱黏膜的修复功能。然而，关于脊髓损伤后透明质酸钠膀胱灌注减轻膀胱黏膜炎症反应的机制尚不完全明确。目前较成熟的观点认为，膀胱表面GAG层的缺陷将导致膀胱上皮缺损，进而改变尿路上皮对尿液成分的通透性，使尿液中的细菌、微晶体、蛋白和离子等毒性物质进入膀胱肌层，引起膀胱炎症[12-13]。也有学者认为，若有害物质进入黏膜下层，便会刺激膀胱间质、致使肥大细胞激活，释放组胺，引起膀胱炎症[14]。

综上所述，透明质酸钠灌注对膀胱黏膜具有一定的保护作用，这为脊髓损伤后神经源性膀胱炎的预防及治疗提供一条全新的思路，但其确切作用机制尚需进一步探讨。由于透明质酸钠具有无抗原性、无致敏性、无致热源性等特点[15]，膀胱灌注时损伤小、并发症少、操作简单易推广，将具有广泛的应用前景。

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Intravesical infusion of sodium hyaluronate enhances bladder mucosal repairing after spinal cord injury in rats

Objective To investigate the effect of sodium hyaluronate on bladder mucosal repair after spinal cord injury in rats．MethodsForty eight rats were randomly divided into 3 groups with 16 in each．No any treatment for rats in group A(normal control);neurogenic bladder model of spinal cord injury was induced with spinal cord transection in groups B (model group)and C(treatment group),then rats in group C was intravesically infused with sodium hyaluronate．The severity of inflammation in bladder mucosa was evaluated by HE staining,histological injury score and IL-6 expression．ResultsLight microscope showed large number of inflammatory cell infiltration,significant expansion of capillary,epithelial cell necrosis in group B;less inflammatory cell infiltration and capillary dilatation in group C．Histological injury score in group B was significantly higher than that in group C(P＜0．05)．The expression of IL-6 in group A was significantly lower than that in groups B and C(P＜0．01);while IL-6 expression in group C was lower than that in group B(P＜0．05)．ConclusionIntravesical infusion of sodium hyaluronate can relieve acute inflammation and enhance the repairing of bladder mucosa in rats after spinal cord injury．

Sodium hyaluronate Spinal cord injury Neurogenic bladderBladder mucosa Repair

2013-11-11）

（本文编辑：欧阳卿）

浙江省医学会临床科研基金项目（2011ZYC-A36）

310009 杭州市第三人民医院泌尿外科