一个Reis-Bucklers角膜营养不良遗传家系的表型分析

程 玄，刘铁城，秦丽敏，徐 玄，刘 伟，陈丽丽，张译心

1解放军总医院 眼科，北京 100853；2解放军总医院海南分院 眼科，海南三亚 572000

Reis-Bucklers角膜营养不良(Reis-Bucklers dystrophy，RBCD)是角膜前部营养不良中较为罕见的的类型，通常为常染色体显性遗传病。TGFBI基因在角膜上皮细胞的表达于1994年被确定为在5p31，也是目前唯一发现与RBCD有关的致病基因。迄今为止，TGFBI基因的的致病突变位点有两个，即R124L和R555Q[1]。除此之外，仅有1个报道证明RBCD与F540缺失有关[2]。根据2008年角膜营养不良国际委员会分型方法(The International Committee for Classification of Corneal Dystrophies，I3CD)[3]，角膜营养不良被分为上皮和上皮下营养不良、Bowman膜营养不良、基质层营养不良、后弹力层及内皮层营养不良。其中颗粒样角膜营养不良(Granular corneal dystrophy，GCD)属于基质层营养不良的一个类型。RBCD既被划分为GCDⅢ型，也被划分为Bowman膜营养不良两个分型中的一种。RBCD作为累及角膜上皮的营养不良，患者常幼时起出现反复发作的角膜上皮糜烂，裂隙灯下可见广泛的上皮缺损，斑点状混浊位于上皮细胞和Bowman层之间。依据角膜混浊的特点和病理特征的不同，又将RBCD进一步分为地图型(geographic pattern)与蜂窝型(honeycomb pattern)两类[4]。目前，文献报道认为TGFBI基因的特定突变导致特定的临床表型，即R124L导致RBCD的地图型，R555Q则导致RBCD的蜂窝型[1]。本研究对1个RBCD家系中9名患者和8名正常成员进行了详细的临床检查和角膜变性表型分析，并对TGFBI基因全部外显子进行检测，明确该家系TGFBI基因突变类型并详细阐述该突变所致的临床表型，为临床诊断及基因型-表型分析提供依据。

对象和方法

1 对象 本研究家系于2013年7月采自海南省三亚市，所有临床检查和血标本的采集在解放军总医院海南分院完成。详细询问家系成员病史，记录患者出现首发症状时的年龄、症状以及病变发展特点。临床检查包括视力，眼压，角膜，隙灯检查和角膜照相以及泪液分泌检查和角膜敏感性检查。

2 外周血DNA制备 本研究通过解放军总医院伦理委员会论证后，所有受检者均签署知情同意书，年龄未满18岁的成员征得本人同意后由父母签署知情同意书。采集该家系中9名患者和5名正常人外周静脉血8 ~ 10 ml，EDTA抗凝。DNA提取采用天根生化科技(北京)有限公司的离心柱型血液基因组DNA抽提试剂盒，按试剂盒使用方法抽提外周血白细胞DNA。-80℃保存待用。

3 TGFBI基因突变检测 应用Primer3软件在线设计引物，对TGFBI基因的第1~16个外显子(exons)及5'和3'端非编码区(untranslated region，UTR)以及内含子(intron)与外显子拼接处序列进行PCR反应。引物由华大基因科技有限公司合成。PCR反应在25 μl体系中进行：2×Taq PCR MasterMix(含染料，蓝色)12.5 μl，正反向引物各5 μl(引物原液加灭菌ddH2O稀释50倍)，DNA模板2.5 μl。反应条件：94℃ 3 min，94℃ 30s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共30个循环，72℃延伸5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭/紫外线鉴定，证实PCR扩增片段存在。PCR产物纯化后，送至华大基因研究院进行直接测序，测序结果采用Chromas软件(2.0)对序列进行对比分析。

结 果

1 RBCD家系患者症状 该家系共有3代14名成员，其中患者9例，正常人5例，RBCD性状呈连续传递现象，男女发病比率为2∶1，其遗传特征符合常染色体显性遗传(图1)。所有患者均为双眼发病，其临床病史和体征符合RBCD诊断，平均年龄16 ~ 84(34.22±7.80)岁，首次发病平均年龄1 ~ 10(3.67±0.90)岁。首次发病症状均有双眼对称性畏光流泪，眼睛疼痛，具体表现为睡醒后角膜疼痛，刺激后疼痛加重，每次疼痛持续时间5 ~ 15(8.50±1.43) d。随着年龄增长，患者眼睛疼痛症状减轻，疼痛减轻的年龄为7 ~ 31(6.00±4.06)岁。该家系9例中有4例(Ⅱ：5，Ⅲ：3，Ⅲ：4，Ⅲ：8)眼睛疼痛最终消失，平均消失年龄为(20.00±7.04)岁，但所有患者畏光症状持续存在。所有患者均表现为阳光下视力差，晚间光线暗时视力改善，可能与角膜混浊从角膜中央区起始并且随病情进展，中央区角膜基质混浊水肿明显有关。因患者角膜不平整，验光无结果，因此，所有患者视力均为未矫正视力。有3例(Ⅰ：1、Ⅱ：2和Ⅱ：5)因角膜上皮严重糜烂和缺损，眼压测量无结果显示而无法记录，家系内患者详细临床检查数据见表1。

图1 RBCD遗传家系图Fig. 1 RBCD family chart.

2 RBCD家系患者体征 家系内患者角膜混浊形态级程度有明显差异。年龄大患病时间长者角膜受累程度比年龄小患病时间短的程度严重。第Ⅲ代所有患者均表现为角膜上皮地图状缺损(图2A)，或灰白色颗粒状混浊和毛玻璃样改变。所有患者角膜周边存在约0.5 ~ 1 mm的未受累的环形透明区域(图2A)。部分患者角膜基质层可见少量线状格子样混浊(图2B)或是雪花状混浊(图2C)。45岁以上患者表现为严重的角膜营养不良改变，出现角膜表面糜烂造成的局部隆起和混浊，呈致密灰白色改变(图2D)，角膜表面斑片状棕褐色改变，似铁锈样色素沉积(图2E)，角膜上皮及前基质层表现为凹凸不平或缺损，水肿累及全基质层，弥漫水肿范围明显扩大(图2F)。该家系患者除有角膜改变外，患者Ⅰ：1和Ⅱ：1角膜变性严重，伴随双眼眼球震颤，考虑可能与患者年幼即出现视力障碍、黄斑部发育异常不能固视有关。

表1 RBCD遗传家系患者临床表型特点Tab. 1 Clinical features of phenotype in RBCD patients

图2 RBCD家系患者角膜营养不良临床表型特点 A： 患者Ⅲ: 7左眼， 可见角膜上皮地图状缺损， 周边透明角膜未受累； B： 患者Ⅲ: 3右眼，角膜基质层可见少量线状混浊和中央区深基质层水肿； C： 患者Ⅲ: 6左眼角膜，显示角膜上皮雪花状混浊； D： 患者Ⅱ： 1右眼，显示角膜表面糜烂造成的多个局部隆起和致密灰白色混浊； E： 患者Ⅱ: 1左眼，显示角膜表面斑片状棕褐色改变，似铁锈样色素沉积； F：患者Ⅱ： 7右眼，角膜上皮及前基质层表现为凹凸不平或缺损，以及广泛角膜深基质层受累Fig 2 Clinic characteristics of RBCD patients with cornea dystrophy A: left eye of patientⅢ: 7, map-like coloboma of the epithelial cells, which evades marginal areas; B: right eye of patientⅢ: 3, line-like opacities were seen in the stroma, the central part of which presented with edema stretching to its deep district; C； fake-like opacities were seen in the epithelial cells of left eye of patient Ⅲ: 6； D： right eye of patient Ⅱ: 1, exhibiting multiple topical apophysis and dense gray opacities; E： left eye of patient Ⅱ: 1, lumping together different types of drab plaques resembling rust pigmentations; F： right eye of patientⅡ: 7, epithelial cells and the anterior part of stroma showing sags and crests fashion, and massive involvement of deeper layers of the cornea stroma

3 测序结果 包括先证者在内的所有患者均检测到TGFBI基因c.418G＞T(p.R124L)的杂合突变，显示100%的外显率，即第4外显子第418位碱基发生杂合突变，该突变导致TGFBI基因第418位碱基由G变为T，密码子由CGC变为CTC，TGFBI蛋白第124位氨基酸由Arg(精氨酸R)变为Leu(亮氨酸L)。家系内正常人和100个正常对照成员DNA检测未见该致病突变，表现为该家系内成员的基因型和表型共分离，该突变可能为此家系的致病突变位点。

讨 论

本文报道了一个由TGFBI基因c.418G＞T(p. R124L)突变引起的RBCD家系。该家系患者在儿童时期出现反复发作的角膜上皮糜烂；角膜混浊起始于前弹力层且呈颗粒样混浊。患者的临床表现主要为畏光、流泪和疼痛，并多在10岁前发病，平均经过4.33(0 ~ 9年)年出现视力逐渐下降。这些临床表现和体征与以往的报道相一致[5-8]。然而，该家系的临床表型与以往报道不同的是角膜水肿累及的程度和范围以及家系内不同患者随着发病时间的不同其角膜变性的程度和形态有明显不同[5-8]。

按照RBCD的特点角膜水肿主要局限在角膜上皮和前弹力层，而本研究家系的一个显著临床表型特点是角膜水肿突破前弹力层并累及深部基质层甚至是全基质层。国内报道显示多数TGFBI p.R124L突变病人的角膜混浊均局限于前弹力层[7-10]，偶有涉及角膜基质层浅层，且进展较为缓慢，较少累积后弹力层。本研究家系中，所有患者角膜混浊均累及到角膜基质，9例患者中4例角膜全层混浊(含后弹力层)，这部分患者年龄为43 ~ 84(55.50±9.61)岁；而角膜未全层受累的患者年龄为16 ~ 19(17.20±0.58)岁。提示随着年龄的增长，病情在不断的向深部浸润和加重；TGFBI p.R124L突变引起RBCD可能不仅局限在角膜上皮和前弹力层，也可累及深部角膜基质层或全基质层。

本家系内患者的临床表型具有高度异质性。随着年龄的增加患者角膜的病变逐渐加重，由起病初始的局限上皮和前弹力层的缺损至后期所表现出来的上皮角膜表面糜烂造成的局部隆起和混浊，呈致密灰白色改变，角膜表面斑片状棕褐色改变以及病变累及深部角膜基质。这在先前TGFBIp. R124L突变引起的角膜变性家系国内报道的文献中不多见。目前为止国内有相关研究发现在2个家系共10个RBCD患者出现了R124L突变，患者角膜病变均局限在前弹力层，呈现出地图状混浊。角膜混浊随年龄的增长逐渐扩大、融合、密度增高[4]。也有研究显示，TGFBIp.R124L突变引起RBCD仅局限在角膜中央区域直径8 mm的上皮区域内呈现地图样混浊，周边角膜为环形透明的未受累区，这和我们的报道相似[7-8]。一项34名法国人因TGFBIp.R124L突变引起的角膜变性家系的临床特性研究也表明，大多数患者的表型都为一致性的病变，即迅速侵犯Bowman膜和浅表基质层的混浊，并且会并发角膜上皮的改变[11]。2000年国外报道了一家系9名TGFBI p.R124L突变引起的RBCD患者上皮地图样缺损位于角膜中央区，少数患者伴有角膜基质层的水肿，此外均未见其他特殊改变[12]。

综上，我们描述了一个中国家系Reis-Bucklers角膜营养不良患者的临床表型。在此RBCD家系中，TGFBI p.R124L突变引起的角膜变性在不同的患者中表现为高度表型异质性，包括角膜上皮地图样缺损，角膜表面糜烂造成的局部隆起和混浊，角膜表面斑片状棕褐色似铁锈样色素沉积，以及水肿累及全基质层等。这些特点在同一家系中同时出现与以往TGFBIp.R124L突变引起的病变局限在角膜上皮和前弹力层的特点有明显不同。

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