三叉苦中6种成分比较研究

杨树娟， 余 玲， 康国娇， 周海瑜， 杨增明，2*

（1.云南良方傣药研发技术中心， 云南 昆明 650217； 2.昆明贝叶傣医药研究所， 云南 昆明 650217）

［饮片炮制］

三叉苦中6种成分比较研究

杨树娟1， 余 玲1， 康国娇1， 周海瑜1， 杨增明1，2*

（1.云南良方傣药研发技术中心， 云南 昆明 650217； 2.昆明贝叶傣医药研究所， 云南 昆明 650217）

目的 比较6种成分在中国南方不同产地、不同季节、不同部位三叉苦样品中的分布情况。方法 样品用甲醇回流提取， 采用 HPLC法测定， 以乙腈 -0.1%磷酸溶液为流动相， 梯度洗脱， 检测波长为 246、 330、 285 nm。 结果6 种成分分离度良好， 检测限低， 在线性范围内各成分均呈良好的线性关系， r＞0.999 7， 平均回收率为 97.84%～100.61%， RSD为1.12% ～3.89%。 结论 来自9 个产地的32 个不同季节、 不同部位样品中， 6 种成分的含有量差异很大， 相对而言吴茱萸春的分布最广， 在云南景谷和金平产三叉苦中含有量较高， 特别是叶， 其他依次为 7-去甲基软木花椒素和 3-异戊烯基伞形花内酯， 3，7-二甲氧基山柰酚和 3，7，3'-三甲氧基槲皮素， 芝麻素仅分布在云南西双版纳产三叉苦叶中。

傣药； 三叉苦； 芝麻素； 7-去甲基软木花椒素； 3-异戊烯基伞形花内酯； 吴茱萸春

目前，已有一些关于三叉苦不同产地、不同部位化学 成 分 比 较 的 研 究 报 道［3-5］。 但 是， 不 同 产地、不同部位三叉苦化学成分差异及其与临床应用的关系，尚需深入研究。同时，为寻找专属性强、与功能主治紧密相关的成分，用于药材和制剂的质量控制，本实验选择1个生物碱类成分吴茱萸春（1）、2 个香豆素类成分 7-去甲基软木花椒素 （2）和 3-异戊烯基伞形花内酯 （3）、 2 个黄酮类成分3，7-二甲氧基山柰酚 （4） 和 3，7，3'-三甲氧基槲皮素 （5）、 1 个木脂素类成分芝麻素 （6）， 作为代表性成分， 采用 HPLC法， 对 6 种成分在不同产地、不同季节和不同部位三叉苦中的分布进行了全面的定量比较研究，为三叉苦有效部位、有效成分研究和药材标准研究及其进一步研究与开发等工作奠定基础。

1 仪器与材料

Waters Acquity-UPLC （ H-Class） 高 效 液 相 色谱仪， PDA Detector， Empower Chemstation； MS105电子天平 （梅特勒-托利多）。 6 种对照品均为自制， 经 MS、1H-NMR、13C-NMR等确定结构， HPLC检查面积归一化法计算纯度均在 97%以上。 乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

在 9 个不同产地采集了 11 个样品 （S1 ～S11）， 共分作 32 个研究用样品，产地、部位和采样日期 （批号的6位数字依次为采样年份、 月份、日期） 见表3， 所有样品均经昆明植物研究所雷立功研究员鉴定为 Evodia lepta （Spreng.） Merr.。凭证标本 （标本号 1201） 存放于昆明贝叶傣医药研究所。将采集的三叉苦样品各部位分开，叶阴干，其余切段或片，晒干，粉碎成粗粉，备用。

2 方法

2.1 色 谱 条 件 Agilent ZORBAX SB-C18色 谱 柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流动相为乙腈 -0.1%磷酸溶液， 梯度洗脱 （0 ～25 min， 35%乙腈； 25 ～27 min， 35% ～42% 乙 腈； 27 ～60 min，42%乙腈）； 吴茱萸春的检测波长为 246 nm， 芝麻素为 285 nm， 其余均为 330 nm， 同时开启 190 ～400 nm紫外光谱检测； 体积流量 1 mL/min， 柱温30 ℃， 进样量 10 μL。

2.2 对照品溶液的制备 分别取吴茱萸春、 7-去甲基软木花椒素、 3-异戊烯基伞形花内酯、 3，7-二甲氧基山柰酚、 3，7，3'-三甲氧基槲皮素、 芝麻素 6种对照品各适量，精密称定，加甲醇制成单个对照品溶 液 母 液， 质 量 浓 度 依 次 为 1.008、2.562、2.520、 1.015、 1.029、 5.000 mg/mL， 分 别 精 密量取1mL， 混合， 稀释至10mL， 即得混合对照品溶液母液。

2.3 供试品溶液的制备 取样品粗粉约2 g， 精密称定， 置 250 mL具塞锥形瓶中， 精密加入甲醇100 mL， 称定质量， 回流提取60 min， 放冷， 再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液 75 mL， 减压浓缩至近干， 加甲醇使溶解并稀释至适宜浓度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性关系、 检测限和定量限考察 取混合对照品溶液母液， 分别稀释 0、 10、 100、 300 倍， 在10、 6、 5、 3、2 μL间， 分别精密吸取适量进样检测，绘制标准曲线，得回归方程和相关系数。以信噪比 s/n 约为 10 时的进样量为定量限，s/n 约为 3时为检测限，结果见表1。

BIM技术的高效应用对建筑工程项目信息管理具有重大影响。新时期，建筑工程人员只有明确BIM技术在项目信息管理中应用的必要性，并在把握其具体应用特征的基础上，做好其在文档信息管理、成本信息管理和进度信息管理等方面的具体应用，才能保证BIM技术应用水平的提升，进而推动建筑工程项目信息管理的进一步发展。

表1 对照品的线性关系和线性范围Tab.1 Linear relationship and linear range of references

2.5 精密度试验 取 “2.4” 项下稀释 10 倍的混合对照品溶液， 按 “2.1” 项下的色谱条件， 连续进样6 次， 结果 6 种化合物的峰面积的 RSD依次为 1.10%、 0.58%、 0.61%、 0.93%、 1.13%、1.54%， 表明仪器和方法的精密度良好。

2.6 重复性试验 取混匀的样品 S5-3 粗粉 6 份，按 “2.3”项下的方法平行制备供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件检测。 结果 6 种化合物的峰 面 积 的 RSD 依 次 为 2.1%、 2.7%、 2.6%、1.9%、 1.7%、 2.4%， 表明该方法的重复性良好。

2.7 稳定性试验 取 “2.6” 项下的同一供试品溶液， 分别于 0、 4、 8、 20、 24 h 时， 按 “2.1”项下的色谱条件检测。结果6种化合物的峰面积的RSD 依 次 为 1.5%、 1.7%、1.9%、2.0%、2.1%、 2.2%， 表明供试品溶液在 24 h 内稳定。

2.8 准确度试验 取混匀的样品 S5-3 粗粉 6 份，每份约 1.0 g， 精密称定。 再分别取 “2.2” 项下单个对照品溶液母液适量， 分别稀释 100 倍， 分别精密量取 10、5、 2、3、 5、 15 mL各 6 份， 加入 6份样品中，加甲醇 60 mL， 分别按 “2.3”、 “2.1”项下的方法依法检测， 计算， 结果见表2。

表 2 各成分的加样回收率 （n=6）Tab.2 Determ ination results of recovery tests（ n=6）

2.9 样品测定 取不同产地、 不同季节、 不同部位三叉苦样品粗粉各约 2 g， 照 “2.3”、 “2.1”项下的方法，依法检测，保留时间一致并紫外吸收光谱一致即认定为同一化合物，计算。色谱图见图1， 结果见表 3。

3 分析

3.1 不同产地 芝麻素是云南西双版纳产三叉苦叶的特征性成分，在其他产地、其他部位中均未检出该化合物；云南景谷和金平产三叉苦中吴茱萸春的量较高， 特别是叶， 高达 1.8% ～3.2%， 而其他产地的叶中均未检出吴茱萸春。

总体上看， 吴茱萸春、 7-去甲基软木花椒素和3-异戊烯基伞形花内酯是 9 个产地三叉苦根和茎的共有成分。景谷的两个样品是不同月份采收的同一植株的不同的两枝，如果作为一个样品计的话，吴茱萸春在除 S11-3 外的所有 14 个根和茎样品中均有检出； 7-去甲基软木花椒素和 3-异戊烯基伞形花内酯都分别在12个样品中检出， 它们仅仅是异戊二烯基在香豆素母核上的位置不同，如果合并计的话，它们也在除 S8-3 外的所有 14 个样品中均有检出。

图1 对照品和样品 HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms

3.2 不同季节 如前所述， S6 和 S7 是标准的两个不同季节样品， S6-3 与 S7-3 中 7-去甲基软木花椒素和 3-异戊烯基伞形花内酯的含有量存在非常大的差异，但 S6-5 与 S7-5 则基本一致。 S4 与 S5，二者并不在同一地点采集，各成分含有量存在一定差异。

表 3 32 个三叉苦样品中 6 种化合物测定结果 （ μg·g-1）Tab.3 Determ ination results of 32 sam p les（ μg·g-1）

3.3 不同部位 相对而言， 吴茱萸春是各部位的共有成分，在叶和/或根中的含有量高于茎，但在多个叶样品中未检出；7-去甲基软木花椒素、3-异戊烯基伞形花内酯、 3，7-二甲氧基山柰酚、 3，7，3'-三甲氧基槲皮素主要存在于茎和根中，均未在叶中检出；芝麻素则未在根、茎中检出。根的成分与茎基本一致而含有量稍高，茎皮的两个黄酮类成分稍高，嫩枝的成分和含有量则介于叶和茎之间。

4 讨论

本研究建立了 HPLC同时测定三叉苦中 6 种成分含有量的方法，操作简便，重复性、回收率等较好， 结果准确可靠。采用该方法对 9个产地的 11份采集样共32个样品进行了测定。

4.1 关于样品的产地和季节 西双版纳的 4 个产地是位于景洪西南约50 km内的 4 个地点， 采集点海拔 670 ～1100 m。 景谷和金平采集点海拔1100 ～1200 m， 位于景洪北部和东部， 西双版纳采集点至景谷直线距离约 160 km，中间有澜沧江相隔， 但无大型山脉相隔； 至金平约 260 km， 有澜沧江和无量山余脉相隔。广东鼎湖山与阳春直线距离约150 km。

从经纬度分析， 云南 6 个产地分布在 N 21°～23°和 E 100°～103°间， 全部 9 个产地分布在 N 21°～23°和 E 100°～112°间， 根据文献［6］， 台湾、海南和西藏墨脱除外，中国三叉苦分布范围在N 21°～25°和 E 99°～117°间。

本研究 11 份采集样品的采收季节分布在 11 月份和3～7月份。

4.2 测定部位和测定成分的选择 目前， 三叉苦商品药材以茎和/或叶为主，嫩枝也是某些药材标准规定的药用部位，民间还有以根、树皮药用的记载［2，7-8］， 据此， 本实验把 三 叉 苦分解为 根、 树皮、茎、嫩枝和叶等5个部位进行比较测定，其中又以茎和叶为主。

三叉苦主要含有生物碱、色烯、香豆素和黄酮等多类具 有 鲜 明结 构 特 点的 化 合 物［5，8-9］， 本 实 验选择1个喹啉类生物碱，2个具异戊二烯结构的香豆素，2个具有多甲氧基的黄酮苷元，以及1个木脂素，进行定量比较研究，具有很好的代表性。6种成分都具有显著的药理活性［9-15］， 因此研究 结果同时具有较强的实际意义。

4.3 色谱条件的确定 比较了甲醇-水、 乙腈-水、乙腈 -0.1%磷酸、 乙腈 -0.1%三氟乙酸、 乙腈 -0.4%冰乙酸等作为流动相， 在不同梯度洗脱条件下的色谱效果，以方法项下的条件色谱效果最好，且能同时测定 6 种成分。6 种成分分别在 246.5（ 321 ）、 332 （ 220 ）、 324、 350 （ 267 ）、 355（253）、 286 （236） nm处有最大吸收峰， 根据各化合物在相应波长下的吸收系数及其含有量高低，以及相应波长下的基线情况和杂质干扰情况，综合研判，选择方法项下的检测波长。

4.4 供试品溶液的制备 分别以不同倍数的甲醇、乙醇、 60%乙醇作为溶剂， 以超声、热回流的方式进行提取，结果以 50 倍量甲醇回流提取的提取率最高、基线最好、最省时省力。样品中各成分的含有量差异较大，经研究确定了最佳取样量，但必要时还需根据测定结果，适当稀释后重复测定，以使各成分均在线性范围内。

4.5 测定结果综合分析 如果不分部位而以全株计， 吴茱萸春分布于全部9 个产地的所有 11个三叉苦采集样中， 7-去甲基软木花椒素和 3-异戊烯基伞形花内酯分布范围次之， 3，7-二甲氧基山柰酚和3，7，3'-三甲氧基槲皮素再次之， 芝麻素仅分布于西双版纳产三叉苦中。

把9个产地分成3个区域，一为云南西双版纳州， 包括 S1 ～S5， 它们的根和茎中均含有除芝麻素以外的5种化合物，且根中的含有量均明显高于茎，为傣医应用根提供了一定的依据，最显著的特征是它们的叶中均含有化合物芝麻素，这很可能成为它们的鉴别指标；二为云南景谷县和金平县，包括 S6 ～S8， 它们的各部位中均未检出 3，7-二甲氧基山柰酚、3，7，3'-三甲氧基槲皮素和芝麻素，7-去甲基软木花椒素和 3-异戊烯基伞形花内酯也仅在部分样品、部分部位中检出，但不仅全部9个样品中均检出吴茱萸春，而且其含有量较高，特别是叶中的含有量高达 1.8% ～3.2%， 这同样很可能成为它们的鉴别指标；三为广西 （梧州市）和广东（鼎湖山及阳春市）， 包括 S9 ～S11，它们的叶中均未检出 6 种化合物，S9-3 和 S10-3 均含有除芝麻素以外的 5 种化合物， S11-3 和-4 中只检出 3-异戊烯基伞形花内酯， S11-1 中检出吴茱萸春和 3-异戊烯基伞形花内酯。

总之，本研究结果表明，不同产地三叉苦的相同部位间，同一产地三叉苦的不同部位间，以及同一产地但不同季节三叉苦的同一部位间，6种化学成分各自的含有量均存在较大差异，但亦有一定的特点和规律。不同产地三叉苦间成分的巨大差异，与其原植物在形态上的地理变异并成为一个多型种［1］有着必然的联系。

综上，为阐明三叉苦药用物质基础，有效控制相关成方制剂及其原料三叉苦药材的质量，有必要在更大的经纬度范围内，更大的时间 （季节）范围内采集更多样品，在同一居群、同一植株内采集多个同一季节及不同季节的样品，进行更多样品、更多成分的定量比较研究，可能还需借助 DNA鉴定等多种技术手段开展研究。同时，需加强样品的鉴定工作，样品应鉴定至原变种和变种，并关注原植物性状的差异，以利于结果的综合分析。

［ 1］ 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志： 第43卷第 2 分册［M］.北京： 科学出版社， 1997： 59-63.

［ 2］ 杨增明， 马志伟， 袁玲玲.傣医药研究［M］.昆明： 云南科学技术出版社， 2012： 76-82.

［3］ 朱盛华，罗 屹，高幼衡，等.三桠苦茎、叶成分的比较研究［J］.广东药学院学报， 2012， 28（3）： 294 ～298.

［ 4 ］ Wei H L， Zhou SX， Jiang Y， et al.Chemical constituents from leaves of Evodia lepta［ J］ .China JChin Mater Med， 2013， 38（8）： 1193-1197.

［ 5 ］ Shaari K， Zareen S， Akhltar M N， etal.Chemical constituents of Melicope ptelefolia ［ J］ .Nat Prod Commun， 2011， 6 （3 ）：343-348.

［6］ 傅国立， 陈潭清，郎楷永， 等.中国高等植物： 第8卷［M］.青岛： 青岛出版社， 2001： 415.

［ 7 ］ Van N H， Kamperdick C， Sung TV， et al.Benzopyran dimers from Melicope ptelefolia ［ J］ .Phytochemistry， 1998， 48 （ 6 ）：1055-1057.

［ 8 ］ Li SG， Tian H Y， YeW C， etal.Benzopyrans and furoquinoline alkaloids from Melicope pteleifolia［J］ .Biochem Syst Ecol， 2011， 39（1）： 64-67.

［ 9］ 朱盛华.三桠苦的化学成分及茎叶成分的比较研究 ［D］.广州： 广州中医药大学， 2009.

［10］ 梁 粤.三叉苦抗炎镇痛作用及脂溶性化学成分研究［D］.广州： 广东药学院， 2010.

［11］ 张国铎， 李 航.香豆素类化合物的药理作用研究进展［J］.中国药业， 2011， 20（17）： 1-3.

［12］ Yoo H H， Lee M W， Kim Y C， et al.Mechanism-based inactivation of cytochrome P450 2A6 by decursinol angelate isolated from Angelica Gigas［ J］ .Drug Metab Dispos， 2007， 35（10 ）：1759-1765.

［13］ 郭瑞霞， 李力更， 霍长虹， 等.槲皮素甲基化衍生物的半合成及构效关系［J］.中草药， 2013， 44（3）： 359-369.

［14］ 张世卿， 张水成.芝麻素研究进展［ J］.氨基酸和生物资源， 2005， 27（3）： 17-21.

［15］ 白金权， 车成日.芝麻素的提取及药理作用研究现状［ J］.延边大学医学学报， 2012， 35（3）： 229-232.

Distribution comparison of six constituents from Evodia lepta

YANG Shu-juan1， YU Ling1， KANG Guo-jiao1， ZHOU Hai-yu1， YANG Zeng-ming1，2*
（1.Liangfang Research and Development Center of Pattra Medicine of Yunnan， Kunming 650217， China； 2.Kunming Institute of Pattra Medicine，Kunming 650217， China）

AIM To compare six constituents in Evodia lepta from different habitats， different harverst time and different parts in south China.METHODS HPLCmethod for six constituents was established with amobile phase consisted of acetonitrile-0.1%phosphoric acid solution in gradient elution manner.The detection wavelength were set up at246， 330， 285 nm.RESULTS The six constituents were well separated ， and showed a good linearity， r=0.999 7-0.999 8.The average recovery was in the ranges of 97.84%-100.61%， RSD 1.12%-3.89%.CONCLUSION The content of all the six constituents showed significant difference in the 32 samples of Evodia lepta from nine habitats.Among these six constituents， evolitrine is themostwidely distributed，relatively high in particular in the leaves from Jinggu and Jinping districts.，7-demethylsuberosin and 3-（3-methyl-but-2-enyl） umbelliferone in turn， kamatakenin and pachypodol the third.Sesamin is only detected in the leaves of Evodia lepta from Xishuangbanna.

Pattra medicine； Evodia lepta； sesamin； 7-demethylsuberosin；3-（3-methyl-but-2-enyl） umbelliferone； evolitrine

R284.1

： A

： 1001-1528（2014）03-0580-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.029

2013-09-26

“十二五” 国家科技支撑计划 （2012BAI27B06-1） ， 云南省科技计划 （2013AE001）

杨树娟 （1983—）， 女， 工程师， 研究方向： 中药及民族药。

*通信作者： 杨增明 （1965—） ， 男， 正高级工程师。 E-mail： bydyy@188.com