伞形花内酯处理对采后徐香猕猴桃果实灰霉病抗的影响

徐文雅 朱玉燕 徐启航 李生娥 沈淑铃 姚兰英 郑小林

(1浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江 杭州 310018；2德清秋水果汁有限公司，浙江 德清 313216)

猕猴桃(Actinidiaspp)采后的主要病害有软腐病、蒂腐病、青霉病、炭疽病和灰霉病等[1]。其中，灰霉病可在猕猴桃的花期、幼果期和贮藏期等各个时期发生，对我国猕猴桃产业造成较大的经济损失[2]。研究表明，灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的猕猴桃采后腐烂率高达30%以上[3-4]。灰霉菌不仅具有较强的潜伏侵染能力，而且其生长温度范围较宽，在低温条件下也能正常生长发育，如在0℃条件下可依旧保持致病力[5]。目前，生产实践中常采用化学杀菌剂来防治灰霉病，但化学杀菌剂残留影响果品的食用安全性。因此，开发安全、有效、无毒的天然杀菌诱抗剂已成为猕猴桃采后研究的热点之一。

伞形花内酯，又名伞形酮、7-羟基香豆素，是芸香科和伞形科香豆素类中最简单的一种多酚物质，主要存在于瑞香狼毒、雪莲等中草药中，具有抗菌、抗氧化、抗癌等多种药理作用，但其含量在天然植物中较低，提取比较困难，目前获得伞形花内酯的途径多为化学合成[6]。伞形花内酯抗细菌和抗真菌活性中等，其中对真菌的最小抑制浓度(minimal inhibit concentration，MIC)为500～1 000 μg·mL-1，其对小鼠的半致死量(median lethal dose，LD50)为450 mg·kg-1[7]。研究表明伞形花内酯对桃褐腐病菌、棉花红腐病菌、草莓灰霉病菌、辣椒炭疽病菌均有抑菌作用，其中对草莓灰霉菌的MIC 为2 000 μg·mL-1[8]，说明伞形花内酯具有广谱抑菌性。浙江工商大学郑小林课题组前期研究发现伞形花内酯能够诱导提高猕猴桃采后果实对青霉病的抗性，有助于保持猕猴桃采后果实品质[9]。为了进一步明确伞形花内酯对猕猴桃果实采后主要病害的控制效果，本试验研究了伞形花内酯处理对采后损伤接种灰霉菌猕猴桃果实的抗病机理，以期为伞形花内酯应用于猕猴桃果实采后病害防治提供理论依据和技术参数。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

美味猕猴桃徐香果实于2018年10月9日采摘自浙江省台州市花积山猕猴桃种植基地，当天运回杭州实验室进行处理。

灰霉菌，浙江省果蔬保鲜与加工技术研究重点实验室保存菌株；伞形花内酯(纯度为99%)，杭州阿拉丁试剂公司。

1.2 仪器与设备

UV-1800 型紫外分光光度计，日本岛津公司；TGL-16M 型高速离心机，湘仪离心机仪器有限公司；HH-S型数显恒温水浴锅，郑州长城科工贸有限公司；SW-CJ-2D 型超净工作台，上海沪粤明科学仪器有限公司；MIR-553 型恒温培养箱，日本SANYO 公司；FMH-5型灭菌锅，日本Takemura 公司；DM4000 型高倍显微镜，德国徕卡显微系统公司；Milli-Q 型超纯水装置，美国MILLIPORE 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 孢子悬浮液的制备 灰霉菌孢子悬浮液的制备参考邵兴锋等[10]的方法。将灰霉菌菌种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar，PDA)上进行多次活化，将活化好的灰霉菌接种于新PDA 平板，在培养箱中培养7 d，将含0.05% Tween-20 的无菌水放于长满灰霉菌的平板，并用无菌涂布棒刮菌，刮完用三层无菌纱布过滤，收集孢子于无菌锥形瓶，调节孢子悬浮液浓度为1.5×106个·mL-1，待用。

1.3.2 试验处理 选取表面无机械损伤、无病虫害、无斑且大小和成熟度基本一致的徐香猕猴桃果实，用1%次氯酸钠溶液浸泡2 min 后，再分别用0、0.5 和1.0 mg·mL-1伞形花内酯溶液浸泡10 min，其中以0 mg·mL-1组为对照(CK)。浸泡完毕自然晾干后放入22℃环境中贮藏48 h，之后用含75% 酒精棉球对猕猴桃赤道部位消毒，用灭菌的铁钉在猕猴桃赤道部位等间距刺3 个3 mm×3 mm 大小的伤口，1 h 后于每个伤口接种20 μL 1.3.1 中制备的灰霉菌孢子悬浮液，分批按每框35 个放入框中，框里放入湿润的纸巾以保持高湿度(相对湿度为85%～90%)，在框外套厚度为0.05 mm 的聚乙烯薄膜袋，袋上扎数个小孔，袋口不封口且自然合拢，置于22℃条件下贮藏。接菌当天按0 d 算，之后每2 d 取一次样，每次取40 个果，取病斑周围1 cm 处果肉作为试验样品，果肉切碎混匀，将CK和处理果实果肉分成三组，用液氮进行速冻并保存在-80℃冰箱，用于后续相关指标的测定。每个指标重复测定3 次。

1.3.3 灰霉菌孢子萌发率和体外菌落直径的测定孢子萌发率:灰霉菌孢子萌发率的测定参考郑剑等[9]的方法。用直径7 mm 无菌打孔器选取无菌的PDA饼，将PDA 饼放置在灭过菌的玻片上，然后将玻片置于中央有润湿滤纸片的培养皿中。在PDA 饼上分别加入30 μL 清水(含无水乙醇)、0.5 mg·mL-1和1.0 mg·mL-1伞形花内酯溶液，待干后，加入20 μL 1.3.1制备的灰霉菌孢子悬浮液，培养8 h 后，在显微镜下观察灰霉菌孢子的萌发情况并测定其萌发率(孢子芽管长度等于或大于孢子直径的一半即视为萌发)，每组重复3 次。

体外菌落直径的测定:灰霉菌体外菌落直径的测定参考郑剑等[9]的方法。经灭菌后的PDA 冷却至55～60℃时，加入清水(含无水乙醇)和伞形花内酯使PDA 中伞形花内酯浓度为0、0.5 和1.0 mg·mL-1，然后倒入培养基中，待冷却凝固后备用。在培养皿中央放入直径为1 cm 的无菌圆形滤纸片，并在上面加入100 μL 1.3.1 制备的灰霉菌孢子悬浮液，26℃培养箱中培养7 d，并分别于第3、第5、第7 天用十字交叉法测定菌落直径。每组重复5 次。

1.3.4 猕猴桃病斑面积的测定 猕猴桃经损伤接种灰霉菌后，于22℃条件下贮藏，分别在第0、第2、第4、第6、第8 天观察果实发病情况并用十字交叉法测定其病斑直径，计算病斑面积，每组每次30 个果，10 个果为1 次重复。

1.3.5 几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶活性的测定几丁质酶(chitinase，CHT) 活性的测定参考Boller等[11]的方法。以每秒钟每克样品(鲜重)中酶分解胶状几丁质所产生的1 μmolN-乙酰葡萄糖胺作为一个CHT 活性单位(U)，用U·g-1FW 表示。每个样品重复测定3 次。

β-1，3-葡聚糖酶(β-1，3-glucanase，GLU)活性的测定参考Zong 等[12]的方法。以每秒钟每克样品(鲜重)中酶分解昆布多糖产生1×10-9mol 葡萄糖作为一个GLU 活性单位(U)，用U·g-1FW 表示。

1.3.6 苯丙氨酸解氨酶和4-香豆酰-辅酶A 连接酶活性的测定 苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase，PAL)活性的测定参考Liu 等[13]的方法。以每小时每克样品(鲜重)酶促反应体系吸光度值增加0.01 为一个PAL 活性单位(U)，用U·g-1FW 表示。

4-香豆酰-辅酶A 连接酶(4-coumarate coenzyme A ligase，4-CL)活性的测定参考黄玉平等[14]的方法。以每分钟每克样品(鲜重)酶促反应体系吸光度值增加0.01为一个4-CL 活性单位(U)，用U·g-1FW 表示。

1.3.7 过氧化物酶和多酚氧化酶活性的测定 过氧化物酶(peroxidase，POD)活性的测定参考Srivastava等[15]的方法。以每分钟每克样品(鲜重)的吸光度值变化0.01 为一个POD 活性单位(U)，用U·g-1FW 表示。

多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)活性的测定参考Sugumaran 等[16]的方法。以每分钟每克样品(鲜重)的吸光度值变化0.001 为一个PPO 活性单位(U)，用U·g-1FW 表示。

1.3.8 总酚、类黄酮和木质素的测定 总酚含量的测定参考Kaur 等[17]的方法。测定样品液在765 nm 波长处的吸光度值，根据吸光度值在标准曲线上查得相应的没食子酸含量(μg)，计算总酚含量。

类黄酮含量的测定参考Wang 等[18]的方法。测定样品液在325 nm 波长处的吸光度值，根据吸光度值在标准曲线上查得相应的芦丁含量(mg)，计算类黄酮含量。

木质素含量的测定参考Syros 等[19]的方法，略作修改。测定样品液在280 nm 波长处的吸光度值，木质素含量用OD280·g-1FW 表示。

1.4 数据分析与统计

采用 Microsoft Office Excel 2016 绘图，SPSS statistics 23.0 软件进行数据的统计分析，显著性水平设置为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 伞形花内酯对灰霉菌孢子萌发率和体外菌落直径生长的影响

由图1-A 可知，灰霉菌经8 h 培养后，CK、0.5 和1.0 mg·mL-1伞形花内酯处理组的灰霉菌孢子萌发率分别是92.33%、54.87%和24.54%，表明0.5 和1.0 mg·mL-1伞形花内酯处理均能显著抑制灰霉菌孢子的萌发(P＜0.05)。由图1-B 可知，离体条件下，灰霉菌菌落直径随着培养时间的延长而扩展，但2 个浓度伞形花内酯处理组在整个培养过程中均显著抑制了灰霉菌菌落直径的扩展(P＜0.05)。

2.2 伞形花内酯处理对猕猴桃果实损伤接种灰霉菌后病斑面积的影响

由图2可知，猕猴桃采后果实损伤接种灰霉菌后，果实的病斑面积随着贮藏时间的延长而不断扩大。与CK 相比，0.5 和1.0 mg·mL-1伞形花内酯处理均显著抑制整个贮藏期间果实病斑面积的扩展(P＜0.05)；但2 个浓度伞形花内酯处理的抑制效果在接种后4～8 d 无显著差异。说明适当浓度伞形花内酯处理能够有效抑制果实损伤接种灰霉菌后的病情发展。

2.3 伞形花内酯处理对猕猴桃果实损伤接种灰霉菌后CHT 和GLU 活性的影响

由图3-A 可知，猕猴桃果实损伤接种灰霉菌后，CK 和处理组CHT 活性均呈先上升后下降的趋势；CK和1.0 mg·mL-1伞形花内酯处理组果实CHT 活性在接种后第4 天出现高峰，而0.5 mg·mL-1伞形花内酯处理组果实的CHT 活性在接种第6 天出现高峰。此外，除1.0 mg·mL-1处理组果实接种后第8 天处，2 个浓度伞形花内酯处理果实的CHT 活性在贮藏期间均显著高于CK(P＜0.05)。

由图3-B 可知，CK 猕猴桃果实的GLU 活性不断上升至第4 天后维持在相对稳定的水平，而0.5 mg·mL-1伞形花内酯处理果实的GLU 活性不断上升，1.0 mg·mL-1伞形花内酯处理果实的GLU 活性不断上升至接种第6 天后开始下降。除1.0 mg·mL-1处理在接种后第8 天外，2 个浓度伞形花内酯处理果实的GLU 活性在贮藏期间均显著高于CK(P＜0.05)。

2.4 伞形花内酯处理对猕猴桃果实损伤接种灰霉菌后PAL 和4-CL 活性的影响

由图4-A 可知，CK 和1.0 mg·mL-1伞形花内酯处理果实的PAL 活性变化趋势相似，呈缓慢上升趋势；而0.5 mg·mL-1伞形花内酯处理果实的PAL 活性呈先上升后下降的趋势，在接种后第4 天达到高峰。除1.0 mg·mL-1处理果实在接种后第8 天外，2 个浓度伞形花内酯处理果实的PAL 活性在贮藏期间均显著高于CK(P＜0.05)。

由图4-B 可知，CK 和1.0 mg·mL-1伞形花内酯处理果实的4-CL 活性均呈先上升后趋于平缓的趋势，而0.5 mg·mL-1伞形花内酯处理果实的4-CL 活性呈波动上升趋势。0.5 mg·mL-1伞形花内酯处理果实的4-CL活性在接种后第4 和第8 天显著高于CK(P＜0.05)，而1.0 mg·mL-1伞形花内酯处理果实的4-CL 活性在接种后第0、第2、第8 天显著高于CK(P＜0.05)。说明伞形花内酯处理诱导提高了苯丙烷代谢途径关键酶PAL 和4CL 的活性。

2.5 伞形花内酯处理对猕猴桃果实损伤接种灰霉菌后POD 和PPO 活性的影响

由图5-A 可知，CK 果实的POD 活性先缓慢降低(0～6 d)，随后急剧上升；0.5 mg·mL-1伞形花内酯处理果实的POD 活性急剧降低在接种第2 天达到最低值，随后急剧增加至接种第6 天后趋于平衡；1.0 mg·mL-1伞形花内酯处理果实的POD 活性先呈下降趋势(0～4 d)，而后急剧增加，在接种第6 天达到最大值，随后又降低至与CK 同水平。0.5 mg·mL-1伞形花内酯处理果实的POD 活性在接种后第4～第8 天显著高于CK，1.0 mg·mL-1伞形花内酯处理仅在接种后第2和第6 天显著高于CK(P＜0.05)。

由图5-B 可知，CK 和0.5 mg·mL-1伞形花内酯处理果实的PPO 活性在贮藏期间均不断增加；1.0 mg·mL-1伞形花内酯处理果实的PPO 活性先呈增加趋势，接种后第6 天达到最大值，而后降低至初始水平。除1.0 mg·mL-1处理在接种后第8 天外，2 个浓度伞形花内酯处理的果实PPO 活性在贮藏期间均显著高于CK(P＜0.05)。说明伞形花内酯处理诱导提高了苯丙烷代谢途径末端氧化酶POD 和PPO 的活性。

2.6 伞形花内酯处理对猕猴桃果实损伤接种灰霉菌后总酚、类黄酮和木质素含量的影响

由图6-A 可知，CK 果实的总酚含量呈波动上升趋势；0.5 和1.0 mg·mL-1伞形花内酯处理果实的总酚含量的变化趋势基本一致，在接种后第0～第6 天呈上升趋势，随后降低。0.5 和1.0 mg·mL-1伞形花内酯处理果实的总酚含量分别在接种后第0、第4、第6 天和第0、第6 天显著高于CK(P＜0.05)。

由图6-B 可知，CK 和处理组果实的类黄酮含量在接种后0～2 d 变化不明显，而后不断增加；除0.5 mg·mL-1伞形花内酯处理果实在接种后第2 天外，2 个浓度处理果实的类黄酮含量在贮藏期间都显著高于CK(P＜0.05)。

由图6-C 可知，CK 和0.5 mg·mL-1伞形花内酯处理果实的木质素含量变化趋势相似，呈波动变化，而1.0 mg·mL-1伞形花内酯处理果实的木质素含量在接种前6 d 略微降低，而后急剧增加。0.5 和1.0 mg·mL-1伞形花内酯处理的果实木质素含量分别在接种后第4～第8 天和接种后第4、第8 天显著高于CK(P＜0.05)。说明伞形花内酯处理能够提高猕猴桃采后果实的总酚、类黄酮和木质素等抗性物质的含量。

3 讨论

灰霉菌是猕猴桃灰霉病的主要病原菌，可在猕猴桃果实生长期侵染，也会在果实采后贮藏期间侵染，导致果实腐烂而失去商品价值[20]。有研究表明，伞形花内酯能够通过破坏灰霉病菌孢子和菌丝体的形态结构起到抑菌效果[21]。本试验结果表明，0.5 和1.0 mg·mL-1伞形花内酯处理均能显著抑制灰霉菌孢子的萌发，且伞形花内酯浓度越高，抑制效果越显著。此外，2 个浓度的伞形花内酯处理均能显著抑制灰霉菌体外菌落的扩展，且1.0 mg·mL-1伞形花内酯处理的抑制效果优于0.5 mg·mL-1，这与伞形花内酯对扩展青霉的抑制效果[9]相似，表明伞形花内酯对一些真菌致病菌具有较好的抑菌效果。同时，接种第2 天后，尽管0.5 和1.0 mg·mL-1伞形花内酯处理对损伤接种灰霉菌猕猴桃果实的病斑扩展未表现显著差异，但2 个浓度处理均能够有效抑制损伤接种灰霉菌猕猴桃果实的病斑扩展，表明适当浓度范围的伞形花内酯处理能够有效控制猕猴桃采后果实灰霉病的病情发展，降低果实腐烂率。

CHT 和GLU 是采后果实在受到生物或非生物胁迫时所诱导产生一类小分子蛋白，即病程相关蛋白(pathogenesis related protein，PR 蛋白)[22]。研究表明，CHT 和GLU 对真菌细胞壁的降解有协同作用，两者能降解真菌细胞壁的主要成分几丁质和β-1，3-葡聚糖，对病原菌有直接杀伤作用[23]。本研究发现，2 个浓度伞形花内酯处理均可显著提高损伤接种灰霉菌后徐香猕猴桃果肉中的CHT 和GLU 活性，表明伞形花内酯处理可能是通过诱导产生PR 蛋白来提高果实的抗病性。

植物可以激活体内苯丙烷代谢来抵御病原菌的侵染，从而增强自身抗病性；其中，PAL 和4CL 是苯丙烷代谢途径的关键酶，其活性高低与寄主抗病强弱密切相关[14，24-25]；POD 和PPO 是苯丙烷途径的末端相关酶，在抗病性中也发挥重要的作用[25-26]。研究发现一些植物诱抗剂提高采后果实的抗病性与其调控果实的苯丙烷代谢相关。例如，甲基水杨酸[27]和褪黑素[28]处理诱导提高番茄等采后果实苯丙烷代谢关键酶活性，进而提高了果实对灰霉病的抗性。本研究发现，与对照相比，伞形花内酯处理不同程度提高了损伤接种灰霉菌猕猴桃果实在贮藏期间的PAL、4CL、PPO 和POD 活性，表明伞形花内酯处理可以通过提高猕猴桃采后果实的苯丙烷代谢相关酶活性来提高果实的抗病力，进而抑制灰霉病的发展。

多酚和类黄酮等酚类物质是植物体内的次生代谢产物，不仅对病原菌有毒害作用，还能被氧化成毒性更高的醌类物质，进一步毒杀病原菌[29]。木质素是细胞壁的主要成分之一，同时也是苯丙烷类代谢的产物之一，细胞壁的木质化是对病原体有效的物理屏障[14，24]。本研究发现，伞形花内酯处理能够提高损伤接种灰霉菌后猕猴桃果实贮藏期间类黄酮含量和贮藏前中期总酚含量，显著提高贮藏中后期木质素的含量。表明伞形花内酯处理能够提高这些抗性物质的含量，进而增强果实的抗病性。

4 结论

本研究发现，外源伞形花内酯能有效抑制灰霉菌孢子萌发和生长。伞形花内酯处理显著提高了损伤接种灰霉菌猕猴桃果实中CHT、GLU、PAL、4CL、POD 和PPO 等防御相关酶活性，以及抗性物质总酚、类黄酮和木质素含量，从而诱导猕猴桃采后果实的抗病性。适宜浓度的伞形花内酯处理能够有效抑制猕猴桃灰霉病的发展，从而降低猕猴桃果实采后腐烂率，提高果实的贮藏性。