九龙化风丸中升麻素苷、 5-O-甲基维斯阿米醇苷、 羌活醇、 异欧前胡素和细辛脂素的 HPLC梯度洗脱法测定

高 森， 李正翔， 王志涛， 房志仲

（1.天津医科大学总医院， 天津 300052； 2.天津医科大学药学院药剂学教研室，天津市临床药物关键技术重点实验室， 天津 300070）

九龙化风丸中升麻素苷、 5-O-甲基维斯阿米醇苷、 羌活醇、 异欧前胡素和细辛脂素的 HPLC梯度洗脱法测定

高 森1， 李正翔1， 王志涛1， 房志仲2*

（1.天津医科大学总医院， 天津 300052； 2.天津医科大学药学院药剂学教研室，天津市临床药物关键技术重点实验室， 天津 300070）

目的 采用高效液相梯度洗脱法测定九龙化风丸 （防风、 羌活、 细辛、 大黄、 桔梗等） 中升麻素苷、 5-O-甲基维斯阿米醇苷、 羌活醇、 异欧前胡素和细辛脂素的量。 方法 Hypersil C18色谱柱 （4.6 mm×150 mm， 5 μm） ， 体积流量 0.9 mL/min， 升麻素苷和 5-O-甲基维斯阿米醇苷的色谱条件， 流动相 A为甲醇-乙腈 （2 ∶1）， 流动相 B为 0.5%磷酸溶液， 检测波长 254 nm。 羌活醇和异欧前胡素的色谱条件， 流动相 A为乙腈， 流动相 B为 0.1%醋酸水溶液， 检测波长 310 nm， 细辛脂素的色谱条件， 流动相为乙腈-甲醇 （85 ∶15）， 检测波长 286 nm。 结果 升麻素苷和 5-O-甲基维斯阿米醇苷分别在 0.014 6 ～0.292 0 μg（r=0.999 1）、 0.010 8 ～0.216 0 μg（r=0.999 3） 范围内进样量与峰面积呈良好的线性关系， 平均加样回收率分别为 97.55%、 97.73%， RSD（n=6） 分别为 1.46%、 1.18%； 羌活醇和异欧前胡素分别在 0.017 4 ～0.348 0 μg（r=0.999 3）、 0.012 8 ～0.256 0 μg（r=0.999 7） 范围内进样量与峰面积呈良好的线性关系， 平均加样回收率分别为 97.62%、 98.11%， RSD （n=6） 分别为 1.43%、 1.39%； 细辛脂素在 0.012 4 ～0.248 0 μg（r=0.999 2） 范围内进样量与峰面积线性关系良好， 平均加样回收率为 97.65%， RSD （ n=6） 为1.24%。 结论 该方法测定结果准确、 灵敏、 重复性好。

九龙化风丸； 升麻素苷； 5-O-甲基维斯阿米醇苷； 羌活醇； 异欧前胡素； 细辛脂素； 梯度洗脱法

九龙化风丸为中药复方制剂，源于卫生部药品标准中药成方制剂第十一册，由防风、羌活、细辛、大黄、桔梗等二十味药物组成。具有镇痉熄风、开窍豁痰的功效，可用于小儿急惊风、癫痫、热病抽搐、 时气瘴疟等症 的治疗［1-3］。 原质 量标准未对方中的任何药味进行成分定量测定，为保证产品质量，确保临床疗效，本实验采用高效液相梯度洗脱法对防风中升麻素苷、 5-O-甲基维斯阿米醇苷和羌活中羌活醇、异欧前胡素以及细辛中细辛脂素进行测定方法研究，为完善该制剂质量标准提供依据，能有效控制产品的内在质量，确保人民用药安全有效。实验结果表明该方法准确、可靠、方便、快速。

1 试药与仪器

高效液相色谱仪 （日本岛津 LC-10ATVP型，岛津自动进样器 SIL-10ADVP）； ANASTAR色谱数据工作站； SPD-1OAVP紫外可见检测器； 升麻素苷对照品 （批号为 111522-201008）、 5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品 （批号为 111523-201007）、 羌活醇对照品 （批号为 111820-201102）、 异欧前胡素对照品 （批号为 110827-200407） 和细辛脂素对照品 （批号为 111889-201001） 均购于中国食品药品检定研究院； 九龙化风丸 （每丸重 2.2g； 批号为130510，130513， 130527） 购于云南腾药制药股份有限公司； 磷酸 （分析纯， 广州化学试剂二厂）；冰醋酸 （色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）； 甲醇、乙腈 （色谱纯， 天津市康科德科技有限公司）。

2 方法与结果

2.1 升 麻 素 苷 和 5-O-甲 基 维 斯 阿 米 醇 苷 的测定［4-9］

2.1.1 色谱条件及系统适应性 Hypersil C18色谱柱 （4.6 mm×150 mm， 5 μm）； 流动相 A为甲醇-乙腈 （2 ∶1）， 流动相 B为 0.5%磷酸溶液， 梯度洗脱 （0 ～28 min， 65%A， 28 ～48 min， 65% →40%A， 48 ～60 min， 40%A）； 检测波长 254 nm；体积流量为 0.9 mL/min。 在此条件下升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷与其他组分分离效果良好，以升麻素苷计理论塔板数应不低于3 500。

2.1.2 检测波长的选择 分别取升麻素苷对照品和 5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品适量， 加 70%甲醇溶解制成每 1 mL含 0.04 mg的溶液， 在 200 ～400 nm波长处进行紫外扫描， 结果升麻素苷对照品和 5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品均在 253 nm处有最大吸收， 同时参考 《中国药典》 2010 年版防风药材含量测定项下检测波长 254 nm， 故将检测波长定为 254 nm。

2.1.3 对照品混合溶液的制备 精密称取升麻素苷对照品和 5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品各适量，加 70%甲醇制成对照品混合溶液 （升麻素苷为0.014 6 mg/mL， 5-O-甲基维斯阿米醇苷为 0.010 8 mg/mL）。

2.1.4 供试品溶液的配制 取本品适量， 剪碎，混匀， 取约 5.0 g， 精密称定， 置具塞锥形瓶中，加 70%甲醇 50 mL，超声处理 （300 W， 30 kHz）30 min，用 70%甲醇补足减失的质量， 摇匀， 过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.1.5 阴性对照溶液的配制 按九龙化风丸处方比例称取适量除防风的其余药味，按九龙化风丸的前处理和制剂生产工艺制成缺防风的阴性样品，按照上述供试品溶液的配制方法制成缺防风的阴性对照溶液。

2.1.6 线性关系考察 精密吸取对照品混合溶液1、 5、10、15、 20 μL， 按上述色谱条件进行测定，以峰面积积分值为纵坐标， 升麻素苷、 5-O-甲基维斯阿米醇苷量为横坐标分别绘制标准曲线，得回归方程。 升麻素苷 Y=4.389 1 ×106X-724.3， r= 0.999 1； 5-O-甲 基 维 斯 阿 米 醇 苷 Y=3.157 3 × 106X+376.4， r=0.999 3。 结果表明升麻素苷在0.014 6 ～0.292 0 μg进样量与峰面积线性关系良好； 5-O-甲基维斯阿米醇苷在 0.010 8 ～0.216 0 μg进样量与峰面积线性关系良好。

2.1.7 阴性对照试验 分别精密吸取 10 μL的供试品溶液、对照品溶液及阴性对照溶液，按“2.1.1” 项的色谱条件进行色谱分析，结果供试品溶液色谱中， 在与升麻素苷对照品和 5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品相同保留时间处有吸收峰，而阴性对照溶液在相同保留时间处未显吸收峰，见图1。

2.1.8 精密度试验 取对照品混合溶液重复进样6 次， 按 “2.1.1” 项的色谱条件测定升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的峰面积， 结果表明， 仪器具有良好的精密度， 升麻素苷和 5-O-甲基维斯阿米醇苷的 RSD分别为 0.68%、 0.72%。

2.1.9 重复性试验 取同一批样品， 按上述方法制备 6 份供试品溶液， 分别测定， 升麻素苷和 5-O-甲基维斯阿米醇苷的 RSD分别为 0.91%、 0.58%。结果表明本方法具有良好的重复性。

2.1.10 稳定性试验 取同一供试品溶液， 在放置0、 1、 2、 4、 6、 8 h 后精密吸取10 μL进样， 测定其峰面积值， 升麻素苷和 5-O-甲基维斯阿米醇苷的 RSD分别为0.66%、 0.89%， 供试品溶液在8 h内基本稳定。

2.1.11 加样回收率试验 取已知含有量 （升麻素苷 0.143 mg/g、 5-O-甲 基 维 斯 阿 米 醇 苷 0.097 mg/g） 的同一批样品适量， 剪碎， 混匀， 取约 2.5 g， 精密称定， 置具塞锥形瓶中， 分别精密加入对照品 混 合 溶 液 25 m L、 70% 甲 醇 25 mL， 按“2.1.4” 项方法制成加样供试品试液。精密吸取加样供试液 10 μL， 按上述测定方法测定其峰面积，计算回收率，结果表明本方法回收率良好，见表1。

图 1 升麻素苷和 5-O-甲基维斯阿米醇苷的 HPLC图Fig.1 HPLC chromatograms of prim-O-glucosylcim ifugin and 4'-O-β-D-glucosyl-5-O-meth-ylvisamm ioside

表 1 升麻素苷和 5-O-甲基维斯阿米醇苷回收率试验结果Tab.1 Results of recovery tests for prim-O-glucosylcim ifugin and 4'-O-β-D-glucosyl-5-O-methylvisamm ioside

2.2 羌活醇和异欧前胡素的测定［10-18］

2.2.1 色谱条件及系统适应性 Hypersil C18色谱柱 （4.6 mm×150 mm， 5 μm）； 流动相 A为乙腈，流动相 B为 0.1%醋酸水溶液， 梯度洗脱 （0 ～22 min， 30.0%A； 22 ～38 min， 30.0% →54.0%A；38 ～55 min， 54.0%A）； 体积流量为 0.9 mL/min，检测波长 310 nm。 在此条件下羌活醇和异欧前胡素与其他组分基线分离良好，以羌活醇计理论塔板数应不低于 3 000。

2.2.2 检测波长的选择 分别取羌活醇和异欧前胡素对照品适量， 加甲醇溶解制成每 1 m L含 0.10 mg的溶液， 按紫外-可见分光光度法在 200 ～400 nm波长处进行紫外扫描， 结果羌活醇和异欧前胡素对照品分别在 310 nm、 312 nm处有最大吸收，同时参考 《中国药典》 2010 年版羌活药材含量测定项下检测波长 310 nm， 故检测波长定为 310 nm。

2.2.3 对照品混合溶液的制备 精密称取羌活醇和异欧前胡素对照品适量， 置 50 mL量瓶中， 加85%甲醇溶解后稀释至刻度， 摇匀， 即得对照品混合溶液 （羌活醇为 0.017 4 mg/mL和异欧前胡素0.012 8 mg/mL）。

2.2.4 供试品溶液的制备 取本品适量，剪碎，混匀， 取约 3.0 g， 精密称定， 置具塞锥形瓶中，精密加入85%甲醇50 mL， 称重， 超声处理 （功率300W， 频率 50 kHz） 40 min， 放冷，再称定质量， 用 85%甲醇补足减失的质量， 摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.5 阴性对照溶液的制备 按九龙化风丸处方比例称取适量除羌活的其余药味，按九龙化风丸的前处理和制剂生产工艺制成缺羌活的阴性样品，按照上述供试品溶液的配制方法制成缺羌活的阴性对照溶液。

2.2.6 线性关系考察 分别精密吸取对照品混合溶液 1、 5、 10、15、 20 μL， 按 “2.2.1” 项下的色谱条件进行梯度洗脱，以峰面积积分值为纵坐标，羌活醇、异欧前胡素量为横坐标分别绘制标准曲线， 回归方程为羌活醇 Y=2.656 7 ×106X-537.5， r=0.999 3； 异欧前胡素 Y=3.587 1 × 106X+671.9， r=0.999 7。 结 果 表 明 羌 活 醇 在0.017 4 ～0.348 0 μg范围内进样量与峰面积线性关系良好；异欧前胡素在 0.012 8 ～0.256 0 μg范围内进样量与峰面积线性关系良好。

2.2.7 阴性对照试验 分别精密吸取 10 μL的供试品溶液、对照品溶液及阴性对照溶液，按“2.2.1” 项的色谱条件进行色谱分析，结果供试品溶液色谱中，在与羌活醇和异欧前胡素对照品相同保留时间处有吸收峰，而阴性对照溶液在相同保留时间处未显吸收峰， 见图2。

图2 羌活醇和异欧前胡素的 HPLC图Fig.2 HPLC chromatograms of notopterol and isoimperatorin

2.2.8 稳定性试验 取同一供试品溶液， 在放置0、 1、 2、 4、 6、8 h 后精密吸取10 μL进样， 测定其峰面积值， 羌活醇和异欧前胡素 RSD分别为0.72%、 0.68%。 结果表明， 供试品溶液 8 h 内基本稳定。

2.2.9 精密度试验 取对照品混合溶液重复进样6 次， 按 “2.2.1” 项的色谱条件测定羌活醇和异欧前胡素的峰面积，结果表明，仪器具有良好的精密度， 羌 活 醇 和 异 欧 前 胡 素 的 RSD 分 别 为0.91%、 0.59%。

2.2.10 重复性试验 取同一批样品， 按上述方法制备6份供试品溶液，分别测定，羌活醇和异欧前胡素的 RSD分别为 0.38%、 0.84%。 结果表明本方法具有良好的重复性。

2.2.11 加样回收率试验 取已知含有量 （羌活醇为 0.275 mg/g、 异欧前胡素为 0.209 mg/g） 的同一批样品适量， 剪碎， 混匀， 取约 1.5 g， 精密称定， 置50 m L具塞锥形瓶中， 分别精密加入对照品混合溶液 25 mL， 加 85%甲醇稀释至刻度， 摇匀，滤过，取续滤液作为加样供试液。精密吸取加样供试液10 μL， 按上述方法测定其峰面积， 计算回收率， 结果表明本方法回收率良好， 见表2。

表2 羌活醇和异欧前胡素回收率试验结果Tab.2 Results of recovery tests for notopterol and isoimperatorin

2.3 细辛脂素的测定［19-21］

2.3.1 色谱条件及系统适应性 Hypersil C18色谱柱 （ 4.6 mm ×150 mm， 5 μm）； 乙 腈-甲 醇（85 ∶15）为流动相， 检测波长 286 nm， 体积流量为 0.9 mL/min。 在此条件下细辛脂素与其他组分分离效果良好，以细辛脂素计理论塔板数应不低于3 000。

2.3.2 检测波长的选择 取细辛脂素对照品适量，加流动相溶解制成每 1 mL含 0.01 mg的溶液， 在200 ～400 nm波长处进行紫外扫描，结果细辛脂素对照品在 286 nm处有最大吸收，故将检测波长定用 286 nm。

2.3.3 对照品溶液的制备 精密称取细辛脂素对照品适量，加甲醇制成含细辛脂素 0.012 4 mg/mL的对照品溶液。

2.3.4 供试品溶液的配制 取本品适量， 剪碎，混匀， 取约 3.0 g， 精密称定， 置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 50 mL，称定质量， 超声 （功率 300 W， 频率 35 kHz） 处理 20min， 再称定质量， 用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，作为供试品溶液。

2.3.5 阴性对照溶液的配制 按九龙化风丸处方比例称取适量除细辛的其余药味，按九龙化风丸的前处理和制剂生产工艺制成缺细辛的阴性样品，按照上述供试品溶液的配制方法制成缺细辛的阴性对照溶液。

2.3.6 线性关系考察 精密吸取对照品溶液 1、5、 10、 15、20 μL，按上述色谱条件进行测定，以峰面积积分值为纵坐标，细辛脂素量为横坐标分别绘制标准曲线，得回归方程。细辛脂素：Y= 6.034 7 ×106X+837.6， r=0.999 2。 结果表明细辛脂素在 0.012 4 ～0.248 0 μg范围内进样量与峰面积线性关系良好。

2.3.7 阴性对照试验 分别精密吸取 10 μL的供试品溶液、对照品溶液及阴性对照溶液，按“2.3.1” 项的色谱条件进行色谱分析，结果供试品溶液色谱中，在与细辛脂素对照品相同保留时间处有吸收峰，而阴性对照溶液在相同保留时间处未显吸收峰，见图3。

图3 细辛脂素的 HPLC图Fig.3 HPLC chromatogram s of asarinin

2.3.8 精密度试验 取对照品溶液重复进样 6 次，按 “2.3.1” 项的色谱条件测定细辛脂素的峰面积，结果表明，仪器具有良好的精密度，细辛脂素RSD为 0.73%。

2.3.9 重复性试验 取同一批样品， 按上述方法制备6份供试品溶液，分别测定，细辛脂素RSD为 0.91%。 结果表明本方法具有良好的重复性。

2.3.10 稳定性试验 取同一供试品溶液， 在放置0、 1、 2、 4、 6、 8 h 后精密吸取10 μL进样， 测定其峰面积值， 细辛脂素 RSD为 0.57%， 供试品溶液8 h内基本稳定。

2.3.11 加样回收率试验 取已知含有量 （细辛脂素 0.19 mg/g） 的同一批样品适量， 剪碎， 混匀，称取1.5 g， 精密称定， 置具塞锥形瓶中， 精密加入对照品溶液 25 mL、甲醇 25 mL， 制成加样供试液。 精密吸取加样供试液 10 μL， 按上述测定方法测定其峰面积，计算回收率，结果表明本方法回收率良好，见表3。

表3 细辛脂素回收率试验结果Tab.3 Resuts of recovery tests for asarinin

2.4 样品测定 取 3 批样品按 “2.1” 项下升麻素苷和 5-O-甲基维斯阿米醇苷测定方法、 “2.2”项下羌活醇和异欧前胡素测定方法和 “2.3” 项下细辛脂素测定方法测定本品， 结果见表4。

表4 样品测定结果 （， n=3）Tab.4 Results of content determ ination（，n=3）

表4 样品测定结果 （， n=3）Tab.4 Results of content determ ination（，n=3）

批 号 升麻素苷/（mg/丸）5-O-甲基维斯阿米醇苷 /（mg/丸）羌活醇/（mg/丸）异欧前胡素/（mg/丸）细辛脂素/（mg/丸）130510 0.315 ±0.004 0 0.213 ±0.002 1 0.605 ±0.010 6 0.460 ±0.007 9 0.418 ±0.002 6 130513 0.328 ±0.005 1 0.227 ±0.002 5 0.587 ±0.006 0 0.501 ±0.007 4 0.391 ±0.003 5 130527 0.303 ±0.005 1 0.237 ±0.004 2 0.622 ±0.007 8 0.436 ±0.006 7 0.430 ±0.005 0

3 讨论

防风、羌活和细辛为方中主要药物，防风具有祛风解表、胜湿止痛、止痉的功效，可用于感冒头痛、风湿痹痛、风湿瘙痒、破伤风等症的治疗；羌活具有散风寒、通鼻窍的功效，可用于风寒头痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻渊等症的治疗；细辛具有祛风散寒、祛风止痛、通窍、温肺化饮的功效，可用于风寒感冒、头痛、牙痛、鼻塞流涕、鼻渊、风湿痹痛， 痰饮喘咳等症的治疗。 同时升麻素苷和 5-O-甲基维斯阿米醇苷为防风主要成分，羌活醇和异欧前胡素为羌活主要成分，细辛脂素为细辛的主要成分，本实验采用高效液相色谱法对防风中升麻素苷、 5-O-甲基维斯阿米醇苷和羌活中羌活醇、 异欧前胡素以及细辛中细辛脂素进行定量测定方法研究，对完善本品的质量标准具有十分重要的作用，能有效控制产品的内在质量。

［ 1 ］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典： 2010 年版一部［S］.北京： 中国医药科技出版社， 2010： 140， 170-171，附录 30， 附录 36.

［2］ 国家药典委员会.国家药品标准：中药成方制剂第十一册［S］.北京： 人民卫生出版社， 1998： 6.

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Determ ination of prim-O-glucosylcim ifugin， 4'-O-β-D-glucosyl-5-O-m ethylvisamm inol， notopterol， isoim peratorin and asarinin in Jiulong Huafeng Pills by HPLC

GAO Sen1， LIZheng-xiang1， WANG Zhi-tao1， FANG Zhi-zhong2*
（1.General Hospital， Tianjin Medical University， Tianjin 300052， China； 2.Department of Pharmacy， College of Pharmacy， Tianjin Medical University， Tianjin Key Laboratary on Technologies Enabling Development of Clinical Therapeutics and Diagnostics（ Theranostics） ， Tianjian 300070， China）

AIM To develop an HPLC method for determining the contents of prim-O-glucosylcimifugin， 4'-O-β-D-glucosyl-5-O-meth-ylvisammioside， notopterol， isoimperatorin and asarinin in Jiulong Huafeng Pills（ Saposhnikoviae Radix， Notopterygh Rhizoma et Radix， Asari Radix et Rhizoma， RheiRadix et Rhizoma，Platycodonis Radix， e tc.）.METHODS An Hypersil C18column was used as the chromatographic column，the flow rate was 0.9 mL/min.For prim-O-glucosylcimifugin and 4'-O-β-D-glucosyl-5-O-methylvisamminol， the mobile phase A consisted ofmethanol-acetonitrile（2 ∶1）， the mobile phase B consisted of 0.5%phosphoric acid solution， UV detection wavelength was set at254 nm.For notopterol and isoimperatorin， themobile phase A consisted of acetonitrile，themobile phase B consisted of0.1%acetic acid solution， the detection wavelength was set at310 nm.For asarinin， themobile phase consisted of acetonitrile-methanol（ 85 ∶15 ） ， the UV detection wavelength was set at286 nm.RESULTS There was a good linear relationship between the concentration of prim-O-glucosylcimifugin， 4'-O-β-D-glucosyl-5-O-methylvisamminol and peak area value when the concentrations of prim-O-glucosylcimifugin and 4'-O-β-D-glucosyl-5-O-meth-ylvisammioside were within the range of 0.014 6-0.292 0 μg（ r= 0.999 1）， 0.010 8-0.216 0 μg（r=0.999 3） .The average recoveries were 97.55% （ RSD=1.46%） and 97.73% （ RSD=0.1.18%） .Therewas a good linear relationship between the concentration of notopterol， isoimperatorin and peak area value when the concentrations of notopterol and isoimperatorin were within the range of 0.017 4-0.348 0 μg（ r=0.999 3）， 0.012 8-0.256 0 μg（ r=0.999 7）.The average recoveries were 97.62% （ RSD=1.43%） and 98.11% （ RSD=1.39%） .There was a good linear relationship between the concentration of asarinin and peak area value when the concentrations of asarinin was within the range of 0.012 4-0.248 0 μg（r=0.999 2）.The average recovery was97.65% （RSD=1.24%）.CONCLUSION Themethod is accurate， sensitive， reproducible andmay be used in the determination of prim-O-glucosylcimifugin， 4'-O-β-D-glucosyl-5-O-methylvisamminol， notopterol， isoimperatorin and asarinin in Jiulong Huafeng Pills.

Jiulong Huafeng Pills； prim-O-glucosylcimifugin； 4'-O-β-D-glucosyl-5-O-methylvisamminol； notopterol；isoimperatorin； asarinin； HPLC； determination

R927.2

： A

： 1001-1528（2014）03-0541-07

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.020

2013-06-15

高 森 （1980—） ， 男， 硕 士， 主 管 药 师， 主 要 从 事 临 床 药 学 和 中 药 质 量 控 制。 Tel： 13920249696， E-mail： gaosenyjk @163.com.

*通信作者： 房志仲 （1959—） ， 男， 教授， 硕士生导师， 主要从事药物制剂与质量控制。 Tel：（022）23542805， E-mail： fangzhizhongtj @163.com