UPLC-MS/MS法测定咳速停糖浆中 3 种兴奋剂类生物碱

朱平川， 岑卫健， 范晓苏

（1.广西大学 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室， 广西 南宁 530004； 2.广西大学化学化工学院， 广西 南宁 530004）

UPLC-MS/MS法测定咳速停糖浆中 3 种兴奋剂类生物碱

朱平川1， 岑卫健1， 范晓苏2

（1.广西大学 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室， 广西 南宁 530004； 2.广西大学化学化工学院， 广西 南宁 530004）

目的 建立同时测定咳速停糖浆中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱以及磷酸可待因3种有效成分的量的超高效液相色谱-串联 质 谱 （ UPLC-MS/MS ） 分 析 方 法。 方 法 用 Agilent Zorbax RRHD Eclipse Plus C18（ 50 mm ×2.1 mm，1.8 μm） 色谱柱， 以甲醇-0.1%甲酸的水溶液为流动相， 体积流量 0.30 mL/min。 在 电喷雾 电离 （ ESI） 正离子 模式下， 采用的是多重反应监测模式 （MRM） 进行检测。 结果 盐酸麻黄碱、 盐酸伪麻黄碱以及磷酸可待因的线性范围分别为 0.001 6 ～4.5mg/L、 0.000 8 ～4.8mg/L、 0.004 ～2.0mg/L； 检出限分别为 0.8 μg/L、 0.4 μg/L、 1.2 μg/L； 3种成分的加样回收率为 91.1% ～104%； 相对标准偏差均不大于 2.6%。 结论 该方法简便、 准确、 快速、 灵敏度高，已成功地用于实际的样品分析。

咳速停糖浆； 生物碱； 超高效液相色谱-串联质谱 （UPLC-MS/MS）

咳速停糖浆由观音草、黄精、白尾参、桔梗、 麻黄、罂粟壳、桑白皮等多味苗族药组成，具有补气养阴，润肺止咳，益胃生津的功效。主要用于感冒及慢性支气管炎引起的咳嗽、咽干、咯痰、气喘。处方中所含的盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、磷酸可待因属于强成瘾性物质，归属于兴奋剂类物质，但同时也是有效成分。为确保制剂的有效性及安全性，必须控制成分含有量。已有文献报道对盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的测定有高效液相色谱法［1-2］、毛细管电 泳 法［3-4］，对 磷 酸 可 待 因 的 检 测主要是高效液相色谱法［5］、 毛细管电泳法［6］、 液质联用法［7］， 但采用超高效液相色谱串联质谱法同时测定咳速停糖浆中的盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、磷酸可待因这3种物质的分析方法尚未见报道。

色谱-质谱联用技术具有专属灵敏、 快速等特点， 已成功用于成分测定［8-10］， 更是成分分析 中定性和定量分析的 有 力 工 具［11-15］。 液 相 色 谱-质 谱 联用技术具有专属灵敏、快速等特点，是中药成分分析中定性和定量分析的有力工具［16］， 本实验建立了同时检测这3种物质含有量的方法，该方法准确、简便快速，已成功地用于实际样品的分析。

1 仪器与试药

1.1 仪 器 1290 Infinity LC System， 6460 Triple Quad LC/MS， 美国 Agilent公 司； Synthesis A10TM超纯水系统， 美国 Millipore公司； Eppendorf Centrifuge 5810R台式高速冷冻离心机，德国 Eppendorf公司； KQ2200DV超声波清洗器， 昆山市超声仪器有 限 公 司， ME 215S 电 子 天 平， 德 国 Sartorius公司。

1.2 试剂 甲醇、 乙腈、 甲酸 （色谱纯）， 美国Fisher公司； 对照品盐酸麻黄碱、 盐酸伪麻黄碱、 磷酸可待因，购自中国药品生物制品检定所；实验用水为超纯水；样品咳速停糖浆，贵州白灵制药有限公司生产， 批号分别为 A20120602、A20120801、A20120607。

2 方法与结果

2.1 色 谱 条 件 采 用 C18色 谱 柱 （2.1 mm × 50 mm， 1.8 μm）；以甲醇 （A） -0.1%甲酸水（B） 为流动相， 梯度洗脱 （0 ～2 min， 95%B；2 ～6min， 95%B～93%B； 6 ～8 min， 93%B～ 80%B； 8.0 ～9.0 min， 80%B～10%B； 9.0 ～10 min， 10%B～0%B； 10 ～12min， 0%B～95% B）； 体积流量 0.30 mL/min； 进样体积 1 μL。

2.2 质谱条件 采用电喷雾电离源 （ESI） 正离子模式， 多重反应检测模式 （MRM模式）。 雾化气为氮气， 压力是 2.8 ×105Pa； 鞘气为氮气， 温度是 360 ℃， 体积流量 12 L/min。干燥气为氮气，温度是 350 ℃， 体积流量 10 L/min。 毛细管电压4 000 V， 喷嘴电压 0 V。 3 种目标组分的其他质谱分析参数见表1。

表1 3种成分的部分质谱分析参数Tab.1 MS analysis on parameters of three components

2.3 对照品溶液的配制 准确称取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、 磷酸可待因对照品各 10.0 mg， 置于10 mL量瓶中， 用甲醇溶解并定容。 对照品贮备液的质量浓度为 1.00 g/L， 于 4 ℃下保存， 使用前用甲醇稀释到所需的质量浓度。

2.4 样品溶液的配制 准确量取咳速停糖浆1 m L， 置于 1.5 mL的 EP管中， 12 000 r/min 离心10 min， 将上清液置于另一个 1.5 mL的 EP管中，用甲醇稀释至 500 mL， 经 0.22 μm的微孔滤膜过滤即可作为样品溶液。

2.5 线性关系及检出限 分别吸取各对照品贮备液适量， 以甲醇稀释配置质量浓度为 0.001 6、0.008、 0.04、 0.2、 1、 2、 4.5 mg/L盐酸麻黄碱系列溶 液，0.000 8、 0.001 6、 0.008、0.04、0.2、1、 2、 4.8 mg/L盐酸伪麻黄碱系列溶液， 0.004、0.01、 0.05、 0.1、 0.5、 1、 2 mg/L磷酸可待因系列溶液，在优化的实验条件下测定，重复3次。以被测组分质量浓度为横坐标，峰面积的平均值为纵坐标进行线性回归， 以信噪比 （S/N） 等于 3 为标准， 测得3种待测组分的检出限， 见表 2， 从表中可看出，各化合物的响应值与质量浓度间均呈现良好的线性关系。

表2 3种组分的线性方程、 相关系数、 线性范围及检出限Tab.2 Regression equations， linear ranges， correlation coefficients（ r2） and detection lim its of three com ponents

2.6 精密度、 稳定性以及重复性 精密吸取对照品贮备液各 10 μL， 混合稀释至 10 mL， 配置成含盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、磷酸可待因各1 mg/L的对照品混合液， 在优化的实验条件下连续进 样 6 次 测 定， 相 对 标 准 偏 差 （RSD） 为0.92% ～1.5%， 结果表明该仪器精密度良好。

取同一批次样品， 按 “2.4” 项制备样品溶液， 在优化后的实验条件下， 分别于 0、 2、4、6、8、 10 h 进样 测定， 相对标 准偏差 （ RSD） 为1.1% ～1.8%， 结果表明供试品溶液在 10 h 内稳定。

同一批次待测样品随机取 6 份，按 “2.4” 项制备样品溶液，在优化的实验条件下分析，相对标准偏差 （RSD） 为 1.1% ～2.3%。 结果表明供试样品重复性良好。

2.7 加样回收率试验 分别精密量取已知这 3 种组分含有量的同一批次咳速停糖浆各 1 mL， 共 9份， 每组 3 份， 按 “2.4” 项方法将样品稀释 500倍来制备样品溶液，加入高、中、低3个质量浓度的混合对照品。在最优化实验条件下进样测定，3种成分的平均回收率见表3。 在添加3个质量浓度的水平下， 3 种成分的加样回收率为 91.1% ～104%， RSD均不大于 2.6%， 可以满足实际样品的测定要求。

表 3 3 种组分在样品中的加样回收率 （n=3）Tab.3 Results of recovery tests of three com ponen ts in sam p les（n=3）

2.8 样品分析 分别精密称取不同批次的样品，按 “2.4” 项制备样品溶液， 按上述优化好的条件进行样品测定， 结果见表4。 对照品及样品的分离情况见图1， 实验结果表明， 该方法可用于盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、磷酸可待因3种有效成分的同时测定。

图1 对照品 （A） 和样品 （B） 的 MRM色谱图Fig.1 M ultip le reaction monitoring chromatogram s of three reference substances（A） and sample（B）

表4 样品测定结果Tab.4 Results of sam p le analysis

3 讨论

3.1 色谱条件的优化 本实验考察了甲醇-水和乙腈-水流动相体系，结果表明使用甲醇-水体系作流动相时灵敏度高于乙腈-水体系，且分离效果更好。在流动相中不添加甲酸时，盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱两个物质峰未能达到基线分离，在此基础上，进一步比较3种物质在不同质量分数甲酸水（0.1%、0.2%、 0.3%、 0.4%） 条 件 下 的 灵 敏度， 结果表明， 0.1%甲酸水最有利于提高灵敏度。3.2 质谱条件的优化 分别对正离子和负离子检测模式进行了比较，实验结果表明采用正离子模式检测这3种物质的检测灵敏度较高。对选定的各待测物的母离子和定量子离子， 在 MRM模式下进行各种参数的优化， 结果见表1。

4 结论

采用 UPLC-MS/MS 技术建立了同时测定咳速停糖浆中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、磷酸可待因3种成分的分析方法。实验结果表明，该方法灵敏度高、定量能力强，准确、快速、简单。该方法的建立有利于进一步完善咳速停糖浆及其类方的质量控制及药代动力学、药物疗效等相关研究。

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Sim ultaneous determ ination of three stim ulant alkaloids in Kesuting Syrupy by UPLC-MS/MS

ZHU Ping-chuan1， CENWei-jian1， FAN Xiao-su2
（1.State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources， Guangxi University， Nanning 530004， China； 2.School of Chemistry and Chemical Engineering， GuangxiUniversity， Nanning 530004， China）

AIM A method for simultaneous determination of ephedrine hydrochloride， pseudoephedrine hydrochloride and codeine phosphate in Kesuting Syrupy was established by ultra performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry（ UPLC-MS/MS） .M ETHODS The UPLC separation was performed on a Zorbax RRHD Eclipse Plus C18column （ 2.1 mm× 50 mm， 1.8 μm） by using methanol and water which contained 0.1%formic acid asmobile phase with the gradient elution at a flow rate of 0.30 m L/min.The analytes were detected by tandem mass spectrometry under the positive ionmode with the ESIsource and carried out in the multiple reaction monitoring（ MRM） mode.RESULTS Under the optimum conditions， the calibration curves were linear in the range of 0.001 6-4.5 mg/L for ephedrine hydrochloride， 0.000 8-4.8 mg/L for pseudoephedrine hydrochloride， 0.004-2.0 mg/L for codeine phosphate.The detection limitswere 0.8， 0.4， 1.2 μg/L， respectively.The average recoveries of the three effective componentswere between 91.1%and 104%with all relative standard deviations notmore than 2.6%.CONCLUSION The developedmethod is simple， rapid and accurate， and suitable for the quality control of the three components in Kesuting Syrupy.

Kesuting Syrupy； alkaloid； ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）

R927.2

： A

： 1001-1528（2014）05-0970-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.019

2013-08-19

广西自然科学基金项目 （桂科自0832034）； 广西大学科研基金项目 （DD703003）

朱平川 （1982—） ， 女， 实验 师， 从 事 色 谱、 质 谱 及 其 联 用 方 法 的 研 究。 Tel： （ 0771 ） 3237743， E-mail： zhupingchuan12@ 163.com