Box-Behnken设计及正交设计优选复方龙砂颗粒提取工艺

曾 锐， 任桂友， 王 爽， 瞿 燕， 盛 蓉

（1.西南民族大学民族医药研究院，四川成都610041；2.成都中医药大学药学院/中药材标准化教育部重点实验室，四川成都611137；3.成都中医药大学附属医院，四川成都 610075）

Box-Behnken设计及正交设计优选复方龙砂颗粒提取工艺

曾 锐1， 任桂友1， 王 爽1， 瞿 燕2*， 盛 蓉3

（1.西南民族大学民族医药研究院，四川成都610041；2.成都中医药大学药学院/中药材标准化教育部重点实验室，四川成都611137；3.成都中医药大学附属医院，四川成都 610075）

目的 优选复方龙砂颗粒的提取工艺。方法 采用响应面法，以挥发油体积为响应值，选取加水量、浸泡时间和蒸馏时间三个因素进行中心组合试验优化挥发油提取工艺；采用正交试验设计，以黄芩苷量和干膏率二者的综合评分值为指标，对挥发油提取残渣与地龙等其余6味药材合并后所进行的提取工艺中的加水量、提取时间和提取次数进行优选。结果 挥发油提取最佳工艺为加10倍量水，浸泡36 min，蒸馏提取5.5 h；水提取最佳工艺为提取3次，每次加水10倍，提取1 h。结论 实验合理的利用了两个设计方案的特点，所优选的提取工艺稳定可行。

Box-Behnken；复方龙砂颗粒；提取工艺；正交设计

复方龙砂颗粒原为中药处方汤剂剂型，由地龙、砂仁、黄芩、苍术等九味中药组成，具有利尿通淋、活血祛毒的功效，临床用于糖尿病合并高尿酸血症的治疗。因汤剂煎煮不便，服用量大，不适于现代用药的需求，故将汤剂改为颗粒剂。

本处方中砂仁、苍术等共三味药材中含有挥发油成分，同属芳香化湿药，可用于湿盛困脾、脘痞腹胀等症。现代药理学研究表明该类药物挥发油多具有抗炎、止泻、镇痛作用，其中苍术挥发油还具有利尿、降血糖作用，且挥发油利尿作用强于水煎液［1-3］。Box-Behnken［4-5］是一种可以评价指标和因素之间非线性关系的实验设计方法，且无需多次试验，故选用Box-Behnken设计对此三味含挥发油的药物进行提取，并以响应面法优选提取工艺。而黄芩中的主要成分黄芩苷具有改善糖尿病肾病及治疗糖尿病慢性并发症的作用［6-7］，因此另以黄芩苷转移率及干膏率两者综合评分作为指标，以加水量、提取时间和提取次数为影响因素，进行正交实验设计，优选水提工艺，以期将该处方的提取工艺最优化并保证临床疗效。

1 仪器与试药

Waters 2695/2996型高效液相色谱仪 （包括真空脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱，2996 PDA检测器，Empower化学工作站，美国 Waters公司）；DiamonsilC18（2）（5 μm，150 mm×4.6 mm）色谱柱；电子天平 （沈阳龙腾电子有限公司，ESJ200-4）；ZDHW型调温电热套 （北京）；旋转蒸发仪 （上海申生科技有限公司，SENCO-R系列）附带恒温水浴锅 （上海申生科技有限公司，SENCO-R系列W201）；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱 （上海一恒科学仪器有限公司）。

地龙、砂仁、黄芩、苍术、黄连等九味药材均购于四川省新荷花中药饮片股份有限公司，经西南民族大学民族医药研究院刘圆教授鉴定。地龙为钜蚓科参环毛蚓Pheretima aspergillum（E.perrier）干燥体，砂仁为姜科植物阳春砂Amomum villosum Lour.的干燥成熟果实，黄芩为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，苍术为菊科植物北苍术Atractylodes chinensis（DC.）Koidz.；黄芩苷对照品 （由中国生物制品鉴定所提供，批号 （110715-201117）；乙醇 （95%）分析纯；其他试剂均为色谱纯。

2 试验方法与结果

2.1 提取工艺 将砂仁、苍术等含有挥发油的药材提取挥发油，残渣与地龙等其余六味药材合并，加适量的水进行提取，测定提取液中黄芩苷质量浓度，计算黄芩苷量。

黄芩苷含有量=提取液中黄芩苷的质量浓度×提取液体积/黄芩药材的质量

2.2 干膏率的测定 精密吸取各提取液50 mL，置已恒定质量的蒸发皿中，按《中国药典》2010年版一部附录 IX G干燥失重测定法测定，计算干膏率。

2.3 黄芩苷的测定方法

2.3.1 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水-磷酸 （47∶53∶0.2）为流动相；柱温为30℃；体积流量为1 mL/min；检测波长为280 nm。在选定色谱条件下，理论塔板数按黄芩苷峰计算应不低于2 500，分离度＞1.5，阴性无干扰。

2.3.2 对照品溶液的制备 取在60℃减压干燥4 h的黄芩苷对照品，精密称取黄芩苷对照品4.73 mg，置于5 mL量瓶中，加适量流动相甲醇超声处理10 min，放冷，加流动相至刻度，摇匀，精密量取1 mL溶液置于10 mL量瓶中，加流动相甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.3.3 标准曲线的绘制 分别精密吸取上述对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，置5 mL棕色量瓶中，加流动相甲醇至刻度，摇匀，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积 （Y）为纵坐标，进样量（X）为横坐标进行回归，得回归方程为y=30 282 891.806 7x+113 730.533 3，相关系数r=0.999 9（n=6）。表明黄芩苷在56.9～682.8 ng范围内线性关系良好。

2.3.4 供试品溶液的制备 精密量取提取液适量于量瓶中，加流动相甲醇适量，超声处理10 min，放冷，再加流动相定容至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.3.5 测定方法 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL注入液相色谱仪，测定，计算提取液中黄芩苷的含有量。

2.3.6 精密度试验 精密吸取黄芩苷对照品溶液0.6 mL，置10 mL棕色量瓶中，加流动相甲醇至刻度，摇匀，即得。按前述色谱条件，连续进样6次，测定峰面积RSD为0.25%，表明仪器精密度良好。

2.3.7 稳定性试验 精密量取同一份供试品溶液10 μL，分别于0、1、2、4、6、8 h进样，按上述色谱条件测定峰面积，测得峰面积RSD为0.33%，表明样品溶液在8 h内稳定性良好。

2.3.8 重复性试验 分别精密量取6份供试品溶液10 μL，按前述色谱条件进行进样，测定峰面积，计算供试品中黄芩苷的量，结果RSD为0.88%，表明该方法重复性良好。

2.3.9 加样回收率试验 取已知含有量供试品溶液6份，分别精密加入一定量的黄芩苷对照品，按上述供试品制备与测定方法进行测定，计算黄芩苷检出量，结果测得黄芩苷平均回收率为100.13%，RSD为0.018%。

2.3.10 阴性对照试验 按处方比例，称取除黄芩药材外的其余各味药材，分别加10倍水，煎煮3次，每次1 h，减压浓缩至500 mL，按上述供试品溶液的制备方法制备阴性供试品溶液。按上述方法测定，结果表明，阴性对照溶液在黄芩苷相应位置无吸收，处方中其他药味对本测定无干扰。

2.4 挥发油提取工艺优选

2.4.1 Box-Behnken设计 依照《中国药典》2010年版一部附录X D挥发油测定法甲法提取挥发油。以挥发油体积为响应值，加水量、浸泡时间及蒸馏时间为影响因素，通过Box-Behnken设计［8-11］进行响应面分析，优化挥发油提取条件。各因素水平见表1。

2.4.2 响应面法分析 实验所得结果 （见表2、表3）经Design Expert 8.0.5b软件进行多元回归拟合及优化，得到挥发油体积对加水量A、浸泡时间B和蒸馏时间C优化后的二元回归方程：

挥发油体积 =－4.550+1.12A－4.922×10－3B+0.088C+7.500×10－4AB－0.057A2－3.556×10－5B2－7.722×10－3C2

对该回归模型进行方差分析，从表3中可以看出，P＜0.000 1，表明响应回归模型达到了极显著水平；失逆差＞0.05，不显著；模型的修正系数R2=0.979 9，说明模型拟合度良好；模型修正相关系数R2Adj=0.964 2，说明该方程较好的反应了加水量，浸泡时间和蒸馏时间与挥发油体积的关系。

表2 挥发油提取响应面分析方案及结果

表3 回归模型方差分

2.4.3 提取工艺预测 由Design Expert 8.0.5b软件分析得出的响应曲面及等高线图 （见图1）可知，加水量对挥发油体积影响最大。经Design Expert软件分析筛选，得到挥发油提取的最佳工艺条件为：加水量10.02倍，浸泡时间35.80 min，蒸馏时间为5.71 h，提取挥发油体积的预测值为1.19 mL。考虑实际操作不便，故将实验条件改为加水量10倍，浸泡时间36 min，蒸馏时间5.5 h。

图1 交互因素作用对挥发油体积影响的效应面及等高线

2.4.4 验证试验 按处方比例取豆蔻、砂仁和苍术药材，共3份，按优选的工艺条件提取挥发油。3次试验挥发油体积分别为1.21、1.19、1.18 mL，RSD为1.28%，表明该工艺稳定可行，重复性好。

2.5 水提工艺条件优选

2.5.1 正交试验 采用正交试验设计［12-15］，以加水量、提取时间、提取次数为考察因素，每个因素确定3个水平，选取正交表L9（34），以黄芩苷转移率为评价指标，对水提工艺进行优选，因素水平表见表4，结果见表5，方差分析见表6。

表4 正交试验因素水平

表5 正交试验结果

表6 正交试验方差分析

结果分析：由表5直观分析可知，影响本制剂提取效果的因素顺序为：煎煮次数＞加水量＞煎煮时间，煎煮次数对提取效果影响最大。经方差分析，煎煮次数对提取效果有极显著影响，加水量和煎煮时间对提取无显著影响，考虑工厂实际工作需要，故确定提取工艺为A2B3C2，即加10倍水，煎煮3次，每次1 h。

2.5.2 验证试验 取处方量药材，平行3份，按确定的最佳水提工艺进行提取，见表7。结果显示，验证试验的黄芩苷转移率优于正交试验中大部分试验结果，说明确定的最佳水提工艺稳定可行。

表7 验证试验结果

3 讨论

3.1 中药成分复杂，多通过配伍组合或者配伍之后产生新的药效成分进而发挥治疗效果，比较重视整体观念。经查阅相关资料得知，该处方中砂仁、苍术等三味药材的挥发油具有一定的抗炎、镇痛、降血糖作用。因此，本实验将挥发油整体单独选作考察指标，以优化提取工艺。同时黄芩药材中的有效成分黄芩苷具有很好的治疗糖尿病慢性并发症的作用，且易溶于水，故以水为溶剂进行提取，并采用正交试验设计优化确保临床疗效。

3.2 Box-Behnken设计多用于确信试验因素对试验指标在非线性影响条件下因素与指标之间的分析，与中心复合设计相比，其可不必连续进行多次试验，且因素数相同时，Box-Behnken要比中心复合设计试验组合数要少。本实验选择该设计方法进行挥发油提取工艺的试验设计，并通过拟合二元回归方程，绘制响应面与等高线图，可直接得出影响因素的变化规律，清晰、准确。另以正交试验设计方法优选水提工艺，在保证试验结果准确的同时减少试验次数，节约成本，节省时间。

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曾 锐 （1976—）男，副教授，博士，主要从事药物制剂及民族药的研究。Tel：（028）85522315，E-mail：Mackzeng@gmail.com

*通信作者：瞿 燕，女，主要从事中药新制剂与新剂型研究。Tel：（028）61800231，E-mail：quyan028@126.com