依达拉奉对肺泡Ⅱ型上皮细胞NF—κB和IL—6，IL—8表达及凋亡的影响

王媛媛+曹建+陈勤+等

1.南昌市第三医院心内科，江西南昌 330009；2.南昌大学第二附属医院麻醉科，江西南昌 330006

[摘要] 目的 探讨依达拉奉对肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的影响及NF-κB和白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）表达。 方法 体外培养肺泡Ⅱ型上皮细胞，用过氧化氢氧化应激建立肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡细胞模型，将细胞分为对照组、过氧化氢组、依达拉奉-过氧化氢组。用MTT法检测依达拉奉对肺泡Ⅱ型上皮细胞增殖能力的影响，流式细胞仪检测依达拉奉对氧化应激肺泡Ⅱ型上皮细胞细胞凋亡的影响，采用ELISA试剂盒及谷胱甘肽（GSH）、脂质过氧化物（MDA）试剂盒检测IL-6、IL-8及GSH、MDA含量，用Western-blot方法检测氧化应激肺泡Ⅱ型上皮细胞中的NF-κB蛋白表达。 结果 依达拉奉-过氧化氢组细胞生长抑制率为（22.3±3.1）%，明显低于过氧化氢组[（37.5±2.4）%]，差异有统计学意义（P < 0.05）。依达拉奉-过氧化氢组MDA含量低于过氧化氢组，GSH含量高于过氧化氢组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。依达拉奉-过氧化氢组IL-6、IL-8含量低于过氧化氢组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。依达拉奉-过氧化氢组细胞凋亡率[（14.67±0.50）%]明显低于过氧化氢组[（38.88±0.80）%]，差异有统计学意义（P < 0.05）。过氧化氢+依达拉奉组NF-κB蛋白水平（2.106±0.012）低于过氧化氢组（4.216±0.127），差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 依达拉奉具有抑制氧化应激后所诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡、下调NF-kB和IL-6、IL-8表达的作用。

[关键词] 依达拉奉；氧化应激；核因子-κB；白介素-6；白介素-8；肺泡Ⅱ型上皮细胞；凋亡

[中图分类号] R563 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）03（a）-0008-05

Effects of Edaravone on apoptosis and the expressions of NF-κB， IL-6， IL-8 in lung epithelial type Ⅱ cells

WANG Yuanyuan1 CAO Jian2 CHEN Qin1 OUYANG Xianguo1 SONG Guoliang1

1.Department of Cardiology， the Third Hospital of Nanchang City， Jiangxi Province， Nanchang 330009， China； 2.Department of Anesthesiology， the Second Affiliated Hospital of Nanchang University， Jiangxi Province， Nanchang 330006， China

[Abstract] Objective To explore the effects of Edaravone on apoptosis and the expressions of NF-κB， IL-6， IL-8 in lung epithelial type Ⅱ cells. Methods Lung epithelial type Ⅱ cells were cultured in vitro， the apoptosis of lung epithelial type Ⅱ cells model was established by hydrogen peroxid. Lung epithelial type Ⅱ cells were divided into three groups： control group， hydrogen peroxide group and edaravone-hydrogen peroxide group， lung epithelial type Ⅱ cells was treated by edaravone. The proliferation rate of lung epithelial type Ⅱ cells were detected by MTT； the apoptosis rate of lung epithelial type Ⅱ cells was determined though flow cytometry； the expression of IL-6， IL-8， GSH， MDA was detected by ELISA kit， GSH kit， MDA kit， the NF-κB protein expression after edaravone treatment was examined through Western-blot. Results Cell growth inhibition rate in edaravone-hydrogen peroxide group [（22.3±3.1） %] was lower than that in hydrogen peroxide group [（37.5±2.4） %]， the difference was statistically significant （P < 0.05）. MDA content in edaravone-hydrogen peroxide group was lower than that in hydrogen peroxide group， GSH content in edaravone-hydrogen peroxide group was higher than that in hydrogen peroxide group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. IL-6， IL-8 content in edaravone-hydrogen peroxide group was lower than that in hydrogen peroxide group， the difference was statistically significant （P < 0.05）. Cell apoptosis rate in edaravone-hydrogen peroxide group [（14.67±0.50） %] was lower than that in hydrogen peroxide group [（38.88±0.80） %]， the difference was statistically significant （P < 0.05）. NF-κB protein level in edaravone-hydrogen peroxide group （2.106±0.012） was lower than that in hydrogen peroxide group （4.216±0.127）， the difference was statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Edaravone can inhibit lung epithelial type Ⅱ cells apoptosis against -oxidative stress and down-regulate the expressions of NF-κB and IL-6， IL-8.

[Key words] Edaravone； Oxidative stress； NF-κB； IL-6； IL-8； Lung epithelial type Ⅱ cells； Apoptosis

急性肺损伤发病过程中，细胞因子可能通过抑制炎症细胞凋亡延长炎性反应时间，促进肺泡上皮细胞凋亡而参与急性肺损伤的炎性反应过程[1]。肺泡Ⅱ型上皮细胞是肺部特异性细胞，可以分泌肺泡表面活性物质，能降低肺泡表面张力，对稳定肺泡形态有一定作用。Ⅱ型细胞又是肺泡的储备细胞，当肺上皮遭受损害，会导致其增生，它是急性肺损伤发病过程中的重要效应细胞[2]。依达拉奉目前研究表明具有清除自由基，抑制氧化性应激，抑制细胞凋亡，可用于治疗氧化应激介导细胞凋亡的神经退行性疾病[3]。本研究通过建立氧化应激诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞细胞凋亡模型，探讨依达拉奉对肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的影响及其与炎症因子的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

RPMI1640培养基HEPES，四氮唑蓝（MTT），二甲基亚砜（DMSO）小牛血清（Gibico公司），IL-6，IL-8 ELISA试剂盒：武汉博士德公司。AnnexinⅤ-PI凋亡检测试剂盒（北京宝赛生物技术有限公司），碱性磷酸酶（AP）显色底物，anti-NF-κB，小鼠单抗辣根酶标记兔抗山羊IgG；anti-β-actin山羊单抗（SantaCruz产品）。依达拉奉（先声药业）。

1.2 人肺泡Ⅱ型上皮细胞的培养及诱导氧化应激

人肺泡Ⅱ型上皮细胞由南昌大学第二附属医院呼吸内科实验室冻存。细胞用含10%小牛血清的RPMI1640培养液在5%CO2，37℃，饱和湿度的细胞培养箱培养，细胞呈贴壁生长，用0.25%的胰酶和0.02%EDTA（1∶1）消化传代，用于实验的细胞均处于指数生长期。根据文献[4]报道方法，分别选用0.1、0.5、1.0 mmol/L过氧化氢（H2O2）处理肺泡Ⅱ型上皮细胞24 h。实验分为对照组（无H2O2处理的肺泡Ⅱ型上皮细胞）、过氧化氢处理的过氧化氢组及依达拉奉（20 μmol/L）-过氧化氢处理的依达拉奉-过氧化氢组。

1.3 肺泡Ⅱ型上皮细胞体外生长活性的检测（MTT法）及谷胱甘肽（GSH），脂质过氧化物（MDA）含量测定

取指数生长期的肺泡Ⅱ型上皮细胞，分别用生理盐水及各浓度过氧化氢（0.1、0.5、1.0 mmol/L）处理，采用0.25%胰蛋白酶消化，以不含细胞的培养液做空白对照。以1×104/孔的密度接种于96孔板，每孔设3个复孔。观察肺泡Ⅱ型上皮细胞贴壁后，加入20 μmol/L依达拉奉，置于孵箱（37℃，CO2）培养24、48、72 h。再加入MTT 20 μl显色，吸弃孔内上清液，每孔加入DMSO，震摇15 min溶解结晶，用酶联免疫仪测490 nm处的吸光度（A490）值。肺泡Ⅱ型上皮细胞生长抑制率=（1-实验组平均A490值/对照组平均A490值）×100%。采用GSH试剂盒，MDA试剂盒检测GSH、MDA含量。

1.4 酶联免疫吸附试验

人肺泡Ⅱ型上皮细胞按1×104/孔接种于96孔板上，分为对照组、氧化应激组、依达拉奉-过氧化氢组，培养结束后收集上清，根据预实验结果对上清进行适当稀释，按ELISA试剂盒说明进行试验。

1.5 AnnexinV-PI

双标记法分析肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率。如上法收集氧化应激组及药物处理72 h后各组细胞，将细胞收获后，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤1次，-20℃ 75%乙醇固定过夜，取出离心收集细胞，PBS洗涤2次，加入10 g/L Rnase 37℃孵育15 min，再加入碘化丙锭（PI）染色30min，尼龙网过滤，采用流式细胞仪检测细胞凋亡，采用CELIQUEST 软件分析早期细胞凋亡率。

1.6 Western blot法检测NF-κB蛋白水平

取对照组、过氧化氢组、依达拉奉-过氧化氢组细胞，加入细胞裂解液，提取总蛋白，收集上清液，考马斯亮蓝法进行担保定量。SDS-PAGE分离样品后电泳转移至硝酸纤维膜上，TBST常温下封闭过夜后，分别加入anti-NF-κB小鼠单抗（一抗）、室温下免疫沉淀1 h，加入辣根酶标记兔抗山羊IgG（二抗）2 h。洗膜，显色。用Gel-ProAnalyzer分析软件分析通道蛋白的灰度值。

1.7 统计学方法

采用统计软件SPSS 15.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 依达拉奉对肺泡Ⅱ型上皮细胞生长增殖能力的影响

过氧化氢氧化应激处理肺泡Ⅱ型上皮细胞后，过氧化氢组细胞生长抑制率为（37.5±2.4）%，明显高于对照组的（3.8±0.8）%，差异有高度统计学意义（P < 0.01），氧化应激可以导致细肺泡Ⅱ型上皮细胞的增殖能力下降。依达拉奉干预后，依达拉奉-过氧化氢组细胞生长抑制率为（22.3±3.1）%，与过氧化氢组比较，细胞生长抑制率下降，差异有统计学意义（P < 0.05），细胞的增殖能力较前升高。提示依达拉奉-过氧化氢组可以改善氧化应激对肺泡Ⅱ上皮细胞的细胞抑制，提高细胞增殖能力。见表1。

表1 各组肺泡II型上皮细胞抑制率比较（%，x±s）

注：对照组比较，*P < 0.01；与过氧化氢组比较，#P < 0.05

2.2 依达拉奉对肺泡Ⅱ型上皮细胞脂质过氧化物、谷胱甘肽水平的影响

MDA是脂质过氧化的分解产物，是反映组织氧化损伤水平的指标之一。GSH在细胞内能清除过氧化物代谢产物，阻断脂质过氧化连锁反应，从而起到保护细胞结构和功能的作用。本实验提示，过氧化氢处理后，与对照组比较，细胞产生MDA显著增加，差异有高度统计学意义（P < 0.01），细胞在氧化应激后，细胞损伤程度明显增加。过氧化氢处理后，与对照组比较，GSH含量显著下降，差异有高度统计学意义（P < 0.01），氧化应激可以通过减少谷胱甘肽对细胞的保护作用引起细胞损伤。经依达拉奉处理后，与过氧化氢组相比，MDA含量下降（P < 0.05），GSH含量升高（P < 0.05），提示依达拉奉可以通过增加谷胱甘肽含量，清除过氧化物代谢，从而减少细胞氧化损伤水平。见表2。

表2 各组脂质过氧化物、谷胱甘肽水平比较（x±s，n = 6）

注：与对照组比较，*P < 0.01，与过氧化氢组比较，#P < 0.05；MDA：脂质过氧化物；GSH：谷胱甘肽

2.3 依达拉奉对肺泡Ⅱ型上皮细胞IL-6、IL-8含量的影响

对照组IL-6、IL-8含量较低，过氧化氢组IL-6、IL-8表达升高，提示氧化应激可以诱导炎症因子IL-6、IL-8释放。依达拉奉处理24 h后，可以减少炎症因子表达，改善氧化应激损伤，炎症因子IL-6、IL-8含量下降，与过氧化氢组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3。

表3 依达拉奉对氧化应激后肺泡Ⅱ型上皮细胞分泌IL-6

和IL-8的影响（ng/L，n = 6，x±s）

注：对照组比较，*P < 0.01；与过氧化氢组比较，#P < 0.05；IL-6：白介素-6；IL-8：白介素-8

2.4 依达拉奉对氧化应激后肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率的影响

通过流式细胞仪检测，对照组、过氧化氢组、过氧化氢-依达拉奉组细胞的凋亡率分别为（4.97±0.40）%、（38.88±0.80）%、（14.67±0.50）%，氧化应激对肺泡Ⅱ型上皮细胞产生细胞损伤，细胞凋亡率明显增加，在依达拉奉处理后，可以减轻细胞膜脂质过氧化连锁反应和炎性反应，减少细胞损伤，从而减少细胞凋亡。见表4。

表4 依达拉奉对氧化应激后肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率的影响（%，x±s）

注：与对照组比较，*P < 0.01；与过氧化氢组比较，#P < 0.05

2.5 依达拉奉对肺泡Ⅱ型上皮细胞细胞NF-κB蛋白水平的影响

过氧化氢处理建立氧化应激模型后，NF-κB在细胞外刺激下被激活，过氧化氢组肺泡Ⅱ型上皮细胞细胞NF-κB蛋白水平增高，与对照组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。依达拉奉干预后，过氧化氢-依达拉奉组NF-κB蛋白水平与过氧化氢组比较有所下降，差异有统计学意义（P < 0.05），可以抑制炎性反应。见表5。

表5 各组细胞NF-κB蛋白水平的影响（x±s）

注：与对照组比较，*P < 0.01；与过氧化氢组比较，#P < 0.05

3 讨论

目前认为，急性肺损伤是机体过度炎性反应导致肺血管内皮细胞和肺泡上皮细胞广泛破坏的结果。急性肺损伤时出现的表面活性物质衰竭的共同的病理特点是肺泡的机械性损伤和肺泡Ⅱ型上皮细胞的过度凋亡[5]。

本研究通过氧化应激建立肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡模型，通过MDA及GSH试剂盒检测MDA、GSH水平，MDA是脂质过氧化的分解产物，是反映组织氧化损伤水平的指标之一。GSH在细胞内能阻断脂质过氧化连锁反应，从而起到保护细胞结构和功能的作用。近年来发现细胞凋亡过程中具有还原性GSH耗竭现象，GSH水平与细胞凋亡密切相关。实验发现过氧化氢处理后，肺泡Ⅱ型上皮细胞GSH含量下降，MDA升高，差异均具有统计学意义。氧化应激损伤诱导了细胞凋亡，细胞生长抑制率增加，细胞凋亡率升高。

NF-κB是一种重要的核内转录因子，在细胞炎性反应、免疫反应以及细胞凋亡等过程中起着重要的作用。NF-κB通常处于非激活状态，当受到细胞外刺激，在IKK酶的激活作用下磷酸化，启动调节炎症因子，本研究发现氧化应激可激活NF-κB，诱导产生多种促炎症细胞因子（如IL-6，TNF-α、IL-1、IL-8等）[6-7]，加重促炎性和抗炎症细胞因子之间的失衡。

IL-8是中性粒细胞重要的趋化因子，是炎症性疾病的重要介质，在抗感染、免疫反应调节以及抗肿瘤方面有重要作用。IL-8对特异性和非特异性的免疫细胞具有强烈的趋化作用，其中主要是对嗜中性粒细胞的趋化和激活作用，导致细胞变形反应，释放溶酶体，形成超氧化物，从而促进炎性反应[8-9]，对淋巴细胞和嗜碱性粒细胞也有趋化作用。IL -6可上调内皮细胞的ICAM-1，并使内皮表达E-选择素，使中性粒细胞黏附于血管内皮细胞表面，形成小栓子，导致微循环障碍[10-11]，还能促进中性粒细胞氧化反应，从而使中性粒细胞在炎性反应部位数量增多，延缓中性粒细胞的凋亡，超氧阴离子释放增多，加重炎性反应[12-13]。

本研究通过氧化应激建立肺泡Ⅱ型上皮细胞的凋亡模型，发现氧化应激诱导细胞凋亡的同时，炎症因子IL-6、IL-8、NF-κB表达增高，而采用依达拉奉干预后，细胞凋亡减少，IL-6、IL-8、NF-κB表达下降。

由此推测，采用双氧水对肺泡Ⅱ型上皮细胞进行处理后，氧化应激激活了NF-κB的表达，进而启动了IL-6、IL-8等炎性因子的表达，从而导致一系列的炎性反应和内皮通透性增高，构成了肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的物质基础。

而依达拉奉是一种强效的新型羟自由基清除剂，经单电子转移作用清除自由基，通过自由基中间体转化，变为稳定的氧化产物[14-15]。可以减轻中性粒细胞浸润及细胞膜脂质过氧化连锁反应，抑制脂质自由基生成，促炎细胞因子表达下调[16-17]。

因此依达拉奉干预后，不仅可以通过自由基清除功能减轻氧化应激的作用，减少氧化应激对NF-κB的活化影响，还有可能直接影响NF-κB、IL-6、IL-8的表达抑制炎性反应的影响，减轻凋亡。此外，有研究证实，NF-κB上调可促进部分细胞存活基因和凋亡抑制基因表达，或活化持续性生长信号，从而保护细胞免于调亡[18-19]。本研究显示，NF-κB下调，IL-6、IL-8表达下调，细胞凋亡减少。提示肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡受炎症因子的影响更加明显，而NF-κB下调所致凋亡基因升高在肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡处于次要地位，其具体机制还需要进一步深入研究。

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（收稿日期：2013-11-18 本文编辑：李继翔）

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（收稿日期：2013-11-18 本文编辑：李继翔）

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（收稿日期：2013-11-18 本文编辑：李继翔）