肌肽对缺氧缺血性脑损伤大鼠凋亡生化指标的影响

张香敏， 张展， 程秀永， 徐发林， 贾天明， 栾斌， 贾莉婷

围产期窒息导致的缺氧缺血性脑损伤(hypoxia-ischemia brain damage，HIBD)是新生儿死亡的主要原因之一。近年来，随着新生儿复苏技术的不断提高，高危新生儿，尤其是早产儿的病死率有明显下降，但重度窒息患儿可遗留不同程度的神经系统功能障碍，如脑性瘫痪、癫痫、共济失调及智力低下等。

凋亡是脑损伤的重要机制之一。有研究证实：肌肽通过减轻神经细胞凋亡，从而减轻缺血性脑损伤[1-3]，因此推测是否肌肽也能通过减轻细胞凋亡减轻缺氧缺血性脑损伤。本研究采用7日龄大鼠制作HIBD模型，探讨肌肽对缺氧缺血性脑损伤大鼠凋亡生化指标的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 7日龄清洁级SD大鼠(证书编号：SCXK(沪)2008-0016)，雌雄不拘，体质量12～18 g，均购自中科院实验研究实验室，并经复旦大学动物伦理委员会批准，按照实验动物有关保护条例进行，在研究期间新生大鼠与母鼠在同一笼内饲养，光照时间12 h，自由摄食水。

1.2 实验分组及方法

1.2.1 实验分组 将42只SD大鼠按随机数字表法分为3组(每组14只)：(1)肌肽预处理组：在HI诱导前30 min腹腔注射肌肽1次250 mg/kg[4，5]；(2)HI组：在相同条件下用等容积的生理盐水代替；(3)假手术组：不接受任何治疗和处理。

1.2.2 HI模型制作 在室温(25±2)℃环境下，将大鼠四肢及头部固定在手术台上，吸入无水乙醚诱导麻醉；皮肤常规消毒后小心剪开颈部皮肤，逐层分离暴露左侧颈总动脉，并小心分离迷走神经，用4个0号外科丝线双线结扎该动脉并从中间剪断，造成永久性断流。此后将大鼠放回到母鼠身边恢复1.5 h，氧氮混合气体(8%氧气/92%氮气)缺氧箱中持续通入湿化的氮氧混合气2 h，缺氧结束即制成7日龄大鼠HI脑损伤动物模型。假手术组动物与HI组动物来自同一窝动物，动物置于相同条件下，既不结扎血管阻断血流，也不置于缺氧箱里缺氧，皮肤切一小口，仅分离左侧颈总动脉。建模完成后动物放回母鼠笼内，并送回动物房，由专人饲养。

1.2.3 原位末端标记(terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL)染色 HI诱导24 h后，将大鼠称重并给予吸入无水乙醚麻醉，暴露心脏后在右心房用眼科剪刀剪一小口，然后经左心室灌注5 mL生理盐水，一直到右心房流出清水，再灌入4%多聚甲醛，直到肢体苍白变硬，迅速剥离脑组织后，然后脑组织在4%多聚甲醛中固定24 h，依次经过梯度酒精和二甲苯脱水后，进行石蜡包埋，脑冠状切片厚度为3 μm，用于TUNEL染色(n=5)。使用原位细胞死亡探测试剂盒，根据生产厂家提供的方案进行TUNEL染色。

1.2.4 实时荧光定量聚合酶链反应(real time polymerase chainreaction，Real-time PCR) 根据厂家提供的说明书，通过细胞裂解液提取损伤侧海马的总RNA(Invitrogen，USA)(n=5)，在紫外分光光度计260 nm处对RNA进行定量，cDNA通过反转录试剂盒合成，严格按照厂家提供的实验步骤进行操作，Real-time PCR通过Real-time PCR仪器(Eppendorf，Germany)逐步进行，基因序列如下：AIF(126 bp)上游引物，5'-GCC AGG GTC CTC ATC GTA TC-3'下游引物，5'-TCC ATT CCA CTG TCT GAA CTG C-3'；Caspase-3(104 bp)上游引物，5'-GCT GGA CTG CGG TAT TGA G-3'下游引物，5'-CGG GTG CGG TAG AGT AAG C-3'；β-actin(104 bp)上游引物，5'-TGT CAC CAA CTG GGA CGA TA-3'下游引物，5'-CAG CAT GTG TTG GCA TAG AGG TC-3'。

1.2.5 计算 根据标准品的不同浓度梯度的Ct值制定标准曲线。各样本的拷贝数则通过与其内参对照后计算，并取以10为底的对数(log拷贝数)。PCR扩增的特异性通过其熔解曲线来确认。

1.2.6 免疫印迹 采用免疫印迹技术检测AIF及Caspase-3蛋白表达水平(n=4)，取左侧海马组织，用蛋白提取试剂盒(购于碧云天生物技术研究所)提取组织蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定，10%聚丙烯酰胺凝胶带电泳分离，湿移至醋酸纤维素膜(NC膜)上，10%小牛血清白蛋白室温摇床上封闭1 h，分别加入稀释抗体AIF 1∶1 000(美国Millipore公司)；Caspase-3 1∶50(美国Biovision公司)4 ℃冰箱孵育过夜，洗涤后，加入1∶3 000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG溶液，室温摇床上孵育1 h，增强化学发光染色，用图像处理仪进行光密度分析，得到各条带的光密度值，以GADPH作为内参照，AIF及Caspase-3与其比值作为相对表达量。

2 结果

2.1 肌肽预处理对大鼠大脑皮质及海马TUNEL阳性细胞数的影响 见表1。

表1 大鼠脑组织TUNEL阳性细胞数的变化

TUNEL阳性细胞表现HI后凋亡的形态学特征，包括染色质浓缩和凋亡小体。免疫荧光结果显示：肌肽预处理显著减少HI 24 h后大脑皮质TUNEL阳性细胞数，与HI组比较差异有统计学意义(P<0.01)；同时，肌肽预处理也显著降低HI 24 h后海马CA1区TUNEL阳性细胞数，与HI组比较，差异亦有统计学意义(P<0.01)；大脑皮质和海马CA1区的TUNEL阳性细胞数在肌肽预处理组和假手术组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 肽预处理对AIF和Caspase-3 mRNA水平的影响 见表2。

表2 大鼠脑组织AIF及Caspase-3基因表达的变化

为了证实肌肽预处理对AIF和Caspase-3 mRNA水平的影响，通过Real-time PCR检测HI 24 h后AIF和Caspase-3 mRNA水平。Real-time PCR结果表明：未经肌肽预处理的HI组动物的AIF mRNA表达高于肌肽预处理组，差异有统计学意义(P<0.05)，肌肽预处理降低了AIF mRNA的表达，与HI组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。同时，未经肌肽预处理的HI组动物的Caspase-3 mRNA水平也高于肌肽预处理组，差异有统计学意义(P<0.01)，肌肽预处理较为显著地抑制了HI后Caspase-3 mRNA水平，与HI组比较，差异亦有统计学意义(P<0.01)。但AIF和Caspase-3 mRNA水平在肌肽预处理组和假手术组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.3 肽预预处理对AIF和Caspase-3蛋白水平的影响 见表3。

表3 大鼠脑组织AIF及Caspase-3蛋白表达的变化

在研究肌肽对AIF和Caspase-3基因水平影响的基础上，为证实肌肽预处理对AIF和Caspase-3蛋白水平的影响，通过免疫印迹检测了肌肽预处理后AIF和Caspase-3蛋白水平。免疫印迹结果表明：未经肌肽预处理的HI组动物的AIF蛋白水平高于预处理组，差异有统计学意义(P<0.01)；同时，未经肌肽预处理的HI组动物的Caspase-3蛋白也表达高于预处理组，差异有统计学意义(P<0.01)。肌肽预处理不仅显著地降低了AIF蛋白水平，而且也降低了Caspase-3蛋白水平；AIF和Caspse-3蛋白水平在肌肽预处理组与HI组比较，差异有统计学意义(P<0.01)，但AIF和Caspase-3蛋白水平在肌肽预处理组和假手术组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。蛋白水平与基因水平变化趋势一致。

3 讨论

近年来有关Capase激活与迟发性细胞损伤即凋亡的关系受到广泛重视。凋亡级联反应代表许多潜在的治疗机会，能够减轻继发性脑损伤，使得临床治疗脑损伤切实可行。Caspase介导细胞凋亡的信号转导，目前公认的各种凋亡刺激因子激活的Caspase家族中的关键蛋白酶是Caspase-3，凋亡可通过Caspase依赖和非Caspase依赖途径诱导，Caspase的活化是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路。AIF是非Caspase依赖细胞死亡途径的主要组成部分，代表一种重要的神经细胞死亡机制。AIF在非Caspase依赖的细胞死亡调节中起着关键的作用，当HI后，由于氧化应激的刺激，引起线粒体内膜的跨膜压减低，线粒体内膜的通透转换孔开放，导致线粒体外膜破裂，AIF由线粒体的膜间腔释放入胞浆，AIF本身是一种脱氧核糖核酸酶，可直接进入核内，促进核染色质浓缩和DNA大片段化[6-8]。与此同时，线粒体膜通透性的改变还可导致细胞色素C和线粒体源Caspase的第二个激活因子释放入胞浆，通过Caspase途径启动凋亡的发生。AIF和Caspase途径在HI介导的神经病理学方面的作用是平行的，互不影响[9]。因此一旦这两条途径被激活就可以通过增加神经细胞的凋亡而导致脑损伤。在HI后数小时脑组织即开始出现神经细胞的凋亡，且随着HI时间的延长，凋亡的神经细胞逐渐增加，24 h以后达到高峰，然后才逐渐减少，并持续较长的时间，到HI后第7天仍有较多的凋亡细胞。与此同时，机体的氧化代谢产物MDA含量也因HI而持续升高，18～24 h达高峰后逐渐下降，与神经细胞凋亡的时程相符合[10]，而氧自由基清除剂SOD的含量在HI后明显降低。本研究结果显示：肌肽预处理不仅抑制HI诱导的AIF和Caspase-3基因表达，而且还抑制AIF和Caspase-3蛋白的表达。

Pekcetin等[1]及许建文等[11]曾报道：肌肽可显著降低脑损伤动物脑组织TUNEL阳性细胞的表达。本研究结果也表明：肌肽预处理显著降低了HI大鼠脑组织TUNEL阳性细胞表达，结果与文献报道一致。由此可推论，肌肽不仅对其他类型的脑损伤具有神经保护作用，而且对HI诱导的脑损伤也具有神经保护作用，而且肌肽的神经保护作用也是通过减少氧化应激从而减少神经细胞的凋亡而实现的。

致谢：非常感谢复旦大学卫生部新生儿疾病重点实验室提供开放合作课题资金赞助及技术支持。

[1] Pekcetin C，Kiray M，Ergur BU，et al.Carnosine attenuates oxidative stress and apoptosis in transient cerebral ischemia in rats[J].Acta Biol Hung，2009，60(2)：137-148.

[2] Dobrota D，Fedorova T，Stvolinsky S，et al.Carnosine protects the brain of rats and Mongolian gerbils against ischemic injury：after-stroke-effect[J].Neurochem Res，2005，30 (10)：1283-1288.

[3] Stvolinsky S，Kukley M，Dobrota D，et al.Carnosine protects rats under global ischemia[J].Brain Res Bull，2000，53(4)：445-448.

[4] Aydin A F，Kusku-Kiraz Z，Dogru-Abbasoglu S，et al.Effect of carnosine treatment on oxidative stress in serum，apoB-containing lipoproteins fraction and erythrocytes of aged rats[J].Pharmacol Rep，2010，62(4)：733-739.

[5] Aydin AF，Kucukgergin C，Ozdemirler-Erata G，et al.The effect of carnosine treatment on prooxidant-antioxidant balance in liver，heart and brain tissues of male aged rats[J].Biogerontology，2010，11(1)：103-109.

[6] Hangen E，Blomgren K，Bénit P，et al.Life with or without AIF[J].Trends Biochem Sci，2010，35(5)：278-287.

[7] Loeffler M，Daugas E，Susin SA，et al.Dominant cell death induction by extramitochondrially targeted apoptosis-inducing factor[J].FASEB J，2001，15(3)：758-767.

[8] Otera H，Ohsakaya S，Nagaura Z，et al.Export of mitochondrial AIF in response to proapoptotic stimuli depends on processing at the intermembrane space[J].EMBO J，2005，24(7)：1375-1386.

[9] Zhu C，Wang X，Huang Z，et al.Apoptosis-inducing factor is a major contributor to neuronal loss induced by neonatal cerebral hypoxia-ischemia[J].Cell Death Differ，2007，14(4)：775-784.

[10] 刘玲，杨于嘉，刘丽旭，等.高压氧对新生大鼠缺氧缺血脑损伤模型脑组织神经细胞凋亡及超氧化物歧化酶和脂质过氧化物的影响[J].中国新生儿科杂志，2007，22(2)：89-92.

[11] 许建文，张光军，邱培勇，等.L-肌肽对高热惊厥幼鼠神经细胞凋亡的影响[J].实用儿科临床杂志，2008，23(12)：913-914，967.