柴油降解菌Acinetobacter sp. AK5的筛选及其降解性能研究

徐晓宇 陈敬华

（江南大学医药学院，无锡 214122）

柴油降解菌Acinetobacter sp. AK5的筛选及其降解性能研究

徐晓宇 陈敬华

（江南大学医药学院，无锡 214122）

从污水处理厂的活性污泥中分离到一株柴油降解菌，通过生理生化鉴定和16S rDNA序列分析，鉴定该菌为不动杆菌Acinetobactersp. AK5。检测了不同pH值、NaCl浓度、培养时间和各种柴油浓度下Acinertobactersp. AK5的柴油降解情况。结果表明，该菌的最适生长初始pH值为5-9，适合NaCl浓度为3%-4%，柴油浓度为5 g/L时，该菌7 d柴油降解率可达99%，柴油浓度为20 g/L时，7 d柴油降解率也可达67%。AK5在人工海水培养基中及无机盐培养基中生长状态良好，在海水和淡水石油污染的生物修复中具有很好的应用前景。

柴油 降解 不动杆菌 降解率

由于全球性广泛的石油开采、运输、使用和处置，石油及其产品的泄漏已经成为世界性的环境问题。在土壤、海洋和大气环境中的石油污染日益严重。据统计全世界每年有1×109t原油及其产品进入环境中，污染土壤、地下水、河流和海洋［1，2］。当前，海洋的石油污染日趋加剧，石油的主要成分包括烷烃、芳香烃和多环芳烃等，石油进入海洋水体后，会产生大面积的油膜，石油污染影响景观，破坏物理环境，油膜能黏附鱼卵与幼鱼，使其死亡。同时油膜减少了太阳辐射投入海水的能量和进入海水中氧的数量，阻隔了海水和空气的相互作用和热交换，阻止海水蒸发，造成水生动物缺氧死亡，从而降低了海洋的自净能力，影响海洋生物的光合作用和生物链循环，进而使海洋生态系统遭到严重破坏，导致受污染的海洋生态系统经过几十年都难以修复［3］。

石油烃污染的处理方法有物理法、化学法和生物法。其中生物处理方法相对于物理和化学方法具有费用低、无二次污染等优点。目前，国内外针对石油烃的微生物降解首先集中于单纯或混合微生物培养物对石油烃的降解动力学及其降解情况［4-6］，近几年，添加表面活性剂［7-9］、添加碳源［10-12］和其它技术［13-16］在提高微生物的石油烃降解效率的研究也有报道。国内外学者也进行了很多关于海洋石油降解菌的筛选研究［17-19］，本研究从污水处理厂的活性污泥中筛选出一株高效柴油降解菌，并对其进行鉴定，研究其在人工海洋培养基中的柴油降解条件以及降解特性，旨在为其在海洋石油污染治理方面的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源 从无锡某生活污水处理厂二沉池中采集活性污泥，用无菌采样瓶带回实验室，4℃保存备用。

1.1.2 培养基 菌株传代用培养基（LB培养基）：蛋白胨10.0 g/L；酵母粉5.0 g/L；NaCl 10.0 g/L；pH 7.0-7.2。

无机盐培养基：柴油10.0 g/L；KH2PO4 2.0 g/L；K2HPO42.0 g/L；KNO31.0 g/L；（NH4）2SO42.0 g/L；NaCl 1.0 g/L；MgSO4·7H2O 0.2 g/L；CaCl2·H2O 0.02 g/L；FeCl2·7H2O 0.01 g/L［6］；微量元素液1 mL，维生素B1 0.004 g/L，pH7.0-7.2，121℃湿热灭菌20 min后补加微量元素液混合液2 mL（经0.22 μm滤膜过滤除菌）。微量元素液配方：H3BO30.1 g/L；MnCl2·4H2O 0.1 g/L；ZnSO4·H2O 0.1 g/L；FeCl3·6H2O 0.1 g/L；CaCl21.0 g/L；CuCl2·2H2O 0.05 g/L。

人工海水培养基（MMC）：NaC1 24 g，KC1 0.7 g，MgSO4·7H2O 0.7 g，NH4NO31 g，KH2PO42 g，Na2HPO4·12H2O 3 g，蒸馏水1 L，pH7.4，并补加柴油10 g作为唯一碳源（0.45 m滤膜过滤除菌）配制。121℃湿热灭菌20 min后补加微量元素液混合液2 mL（经0.22 μm滤膜过滤除菌）。微量元素溶液：MgSO4·7 H2O 4 g，CuSO4·5H2O 1 g，MnSO4·H2O 1 g，FeSO4·7H2O 1 g，CaC121 g，蒸馏水1 L。

1.2 方法

1.2.1 柴油降解菌的富集和分离

1.2.1.1 菌源富集 配制无机盐培养基，250 mL的三角烧瓶加入100 mL培养基，灭菌后，加入活性污泥，加入1 mL柴油，放入恒温振荡培养箱以转速120 r/min，30℃恒温培养。取上述培养3 d后的混合培养液进行接种驯化，30℃、150 r/min恒温振荡培养7 d。驯化时，先取5 mL富集后的培养液到含有最低柴油浓度的新鲜驯化培养液中，培养7 d，然后从中取出5 mL培养液加入含有较高原油浓度的驯化培养液中，再次培养7 d。重复3次。

1.2.1.2 单菌株的分离 将筛选出的能以柴油为唯一碳源生长的混合菌分别接种到柴油浓度为0.5%的人工海水培养基中，在恒温摇床上进行振荡培养，在LB固体培养基上利用平板划线方法进行单菌株的分离。

1.2.2 柴降解菌株的鉴定 将一株降解能力较好的菌株命名为AK5，将该菌株划线接种LB培养平板上培养后挑取单菌落，于斜面培养进行培养24 h，革兰氏染色后并进行生理生化鉴定。用DNA快速提取试剂盒提取菌株AK5基因组DNA，采用16S通用引物（27F：5'-AGAGTTTGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；1492R：5'-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）对AK5的16S rDNA序列进行PCR 扩增，反应体系（25 μL）为：模板DNA 1 μL，Taq10×缓冲液5 μL，dNTP 100 mol/L，DNA聚合酶2.5 U，上下游引物各1 μL。PCR反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1.5 min，循环30次；72℃延伸10 min。电泳割胶回收后，将PCR产物与pMD19-T载体连接，转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中，通过蓝白斑筛选阳性重组子，送华大基因测序。将测得的16S rDNA序列在NCBI的GenBank进行比对，对获得的同源序列进行分析，采用Neighbor-Joining（N-J）法构建进化树。

1.2.3 柴油降解菌降解特性

1.2.3.1 pH对菌株柴油降解的影响 将体积分数10%的AK5菌液接种到人工海水培养基中，在30℃，200 r/min，柴油浓度为10 g/L，pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，培养7 d，分别检测其柴油降解率。

1.2.3.2 NaCl浓度对菌株柴油降解的影响 将AK5菌液按照10%体积比接种到NaCl分别为0、1%、2%、3%、4%和5%的人工海水培养基中，在30℃，200 r/min，柴油浓度为10 g/L的条件下培养7 d，分别检测其柴油降解率。

1.2.3.3 柴油浓度对菌株柴油降解的影响 将AK5按照10%体积比接种到人工海水培养基中，其柴油浓度分别为5、10、15和20 g/L，培养7 d，每天取样，检测其在不同柴油浓度下的柴油降解率。

1.2.3.4 培养基对AK5柴油降解的影响 将AK5按照10%体积比分别接种到无机盐培养基和人工海水培养基中，柴油初始浓度为5 g/L。每天取样，检测其不同培养基培养条件下的柴油降解率。

1.2.4 柴油降解率的检测 将AK5在含不同石油烃组分培养液中培养，以紫外分光光度法在230 nm波长下检测柴油浓度［20］计算降解率。

2 结果

2.1Acineitobactersp. AK5菌株的形态特征与16S rDNA序列分析

柴油降解菌Acinetobactersp. AK5，菌落圆形，黄白色，表面光滑，革兰氏染色阴性球杆菌、无鞭毛、有荚膜、不产芽孢、不发酵葡萄糖、乳糖、甘露糖、麦芽糖、吲哚试验阴性、甲基红试验结果阴性、VP试验阴性，有溶血环。经16S rDNA测序及GenBank比对，并采用N-J法构建分子进化树，该菌与不动杆菌属有99%以上的相似性，综合上述分析结果将此菌株鉴定为不动杆菌菌属，命名为AK5（图1）。

2.2 AK5在不同初始pH值下的柴油降解率

柴油降解菌AK5在不同初始pH条件下的柴油降解率（图2）显示，AK5在初始pH为6时降解率最高，可达90%，而在初始pH10时柴油的降解率则降到10%以下。细菌在pH5-9的范围内均有较好的降解率，说明AK5适合在中性偏碱性的条件下生长。而AK5在pH6-9范围内7 d柴油降解率均可以达到50%以上，能更好地适应海洋环境。

2.3 AK5在不同NaCl浓度下的柴油降解率

研究了NaCl浓度为0-5%条件下柴油降解菌的降解情况（图3）表明，在NaCl浓度为0-4%的条件下，AK5均有较好的柴油降解率。其中不含NaCl条件下AK5的柴油降解率在62%，3% NaCl浓度下AK5的柴油降解率达95.6%，但在NaCl浓度为5%时，柴油降解率降到48%，因此AK5的最适生长的海水NaCl浓度为3%-4%，其最高耐受范围是4%，适应自然海洋环境水体中的NaCl浓度。

2.4 不同柴油浓度下AK5的柴油降解率

分别在不同初始柴油浓度下研究柴油降解率，结果（图4）表明，AK5菌株的柴油降解率随着柴油浓度升高而降低，柴油浓度为5 g/L时柴油的降解率最高，第1天降解率就在42.5%，第7天降解率为99%。柴油浓度为20 g/L时，AK5的柴油7 d降解率也能达到将近60%。而AK5对质量浓度为5 g/L的柴油3 d降解率即超过60%。因此认为AK5能更好地适用于降解高浓度柴油污染水体。

2.5 在不同培养基条件下AK5的柴油降解情况

分别将AK5按照10%的接种体积，接种到无机盐培养基和人工海水培养基中，柴油初始浓度为5 g/L。每天取样，检测其不同培养基培养条件下的柴油降解率，结果（图5）表明，AK5在上述两种培养基中均生长良好，在培养前4 d中，AK5在无机盐培养基中的柴油降解率要高于海水培养基，培养1 d后，无机盐培养基中柴油降解率为50%以上，而人工海水培养基为40%，但是第6、7天，在两种培养基中的柴油降解率趋于一致，在培养7 d后柴油降解率均达到99%。由此可见，AK5在淡水及海水环境下均生长良好并能够保持较高的柴油降解率，因此可以用于淡水水体和海洋水体的柴油生物处理。

3 讨论

生物技术修复是海洋受到石油烃污染后采用的一种主要修复手段，而其中最关键的环节就是获得具有高效降解活性的降解微生物。目前已知海洋中最主要的石油烃降解细菌有：无色杆菌属（Achromobacter）、不动杆菌属（Acinetobacter）、产碱杆菌属（Alcaligenes）等。近年来国内分离到的海洋石油烃降解菌有：刘陈立等［21］分离得到的食烷菌（Alcanivoraxsp. B-5）；陈碧娥等［22］从湄洲湾污染水样中分离得到的假单胞菌（Pseudomonassp. H1），谭田丰等［23］从胜利油田黄河码头近岸表层海水分离得到的不动杆菌（Acinetobactersp. PN3-2）和苏莹［24］分离到的不动杆菌（Acinetobactersp. HB-1）和周常义［25］的Acinetobactersp. JMUXMS-100等。

从已经报道的柴油降解菌的种属分布来看，它们可以分布在广泛的种属中，但是以Acinetobacter居多，本研究分离得到的菌株也属Acinetobacter，但是与其他研究不同的是，本研究获得菌种的来源并非从受到石油烃污染的海洋环境中获得，而是从城市生活污水处理厂活性污泥中分离得到，这说明石油烃类降解菌分布广泛，具有很强的适应性。柴油降解菌的生长条件和降解能力对后续的应用非常重要，因此本试验进一步研究了其生长条件和降解特性。从初始pH和NaCl浓度来看，AK5主要是在中性偏碱性的条件下生长较佳，这与其他研究者分离得到的柴油降解菌生长条件类似。在NaCl浓度为0-4%的条件下，AK5均有较好的柴油降解率，但是从降解率曲线可以看出，AK5在NaCl浓度为3%-4%条件下，其柴油降解率（95.6%）反而高于在不含NaCl条件下的降解率（62%），说明该菌非常适合海洋环境（盐分含量约3.5%）下应用。

有关AK5降解能力的结果表明，其降解能力优良，在已经报道的一些菌属中，降解效果较佳，表1列出了一些公开报道的柴油降解菌的降解条件和性能。此外，AK5在人工海水培养基和普通的无机盐培养基中，均具有较好的柴油降解能力，说明该菌种适合于淡水和海水条件下的应用。

4 结论

本研究从污水处理厂的活性污泥中筛选出一株高效柴油降解菌，经鉴定为不动杆菌，Acinetobactersp. AK5。AK5在人工海水培养基条件下，在pH5-9时，NaCl浓度0-4%，柴油浓度5-20 g/L的条件下均能高效降解柴油。其中柴油浓度为20 g/L时7 d柴油降解率仍可达67%，优于已报道的海洋微生物。AK5在无机盐培养基及人工模拟海水培养基中均生长良好，在淡水水体及海水水体中的石油烃污染处理中均有良好的应用前景。

［1］周长征, 李秀云, 宋延博.三维荧光法在石油污染鉴别中的应用［J］.光谱学与光谱分析, 1998, 18（4）：500-502.

［2］Watanabe K, Kodama Y, Syutsubo K. Molecular characterization of bacterial populations in petroleum-contaminated ground water discharged from underground crude oil storage cavities［J］. Appl Environ. Microbiol, 2000, 66（11）：4803-4809.

［3］ 景伟文, 杨桂朋, 康志强.海洋溢油污染对生物群落和种群的影响及生态系统的恢复［J］.海洋湖沼通报, 2008（1）：81-88.

［4］Mohanty G, Mukherji S. Biodegradation rate of diesel range n-alkanes by bacterial cultures Exiguobacterium aurantiacum and Burkholderia cepacia Gita Mohanty, Suparna Mukherji［J］. International Biodeterioration & Biodegradation, 2008, 61：240-250.

［5］Mercedes M, Ana P, Santiago R, et al. Biodegradation of diesel and heating oil byAcinetobactercalcoaceticusMM5：its possible applications on bioremediation［J］. International Biodeterioration & Biodegradation, 1995, 35：269-285.

［6］Nievas ML, Commendatore MG, Esteves JL, Bucal V. Biodegradation pattern of hydrocarbons from a fuel oil-type complex residue by an emulsifier-producing microbial consortium［J］. Journal of Hazardous Materials, 2008, 154：96-104.

［7］Wang LM, Liu PW, Ma CC, Cheng SS. Application of biosurfactants, rhamnolipid, and surfactin, for enhanced biodegradation of dieselcontaminated water and soil［J］. Journal of Hazardous Materials, 2008, 151：155-163.

［8］Wang LM, Liu PWG, Ma CC, Cheng SS. Application of rhamnolipid and surfactin for enhanced diesel biodegradation—Effects of pH and ammonium addition［J］. Journal of Hazardous Materials, 2009, 164：1045-1050.

［9］ Wyrwas B, Chrzanowski Ł, Ławniczak Ł, et al. Utilization of Triton X-100 and polyethylene glycols during surfactant-mediated biodegradation of diesel fuel［J］. Journal of Hazardous Materials, 2011, 197：97-103.

［10］ Östberg TL, Jonsson AP, Bylund D, Lundström US. The effects of carbon sources and micronutrients in fermented whey on the biodegradation of n-hexadecane in diesel fuel contaminated soil［J］. International Biodeterioration & Biodegradation, 2007, 60（4）：334-341.

［11］ Jonsson A, Östberg TL. The effects of carbon sources and micronutrients in whey and fermented whey on the kinetics of phenanthrene biodegradation in diesel contaminated soil［J］. Journal of Hazardous Materials, 2011, 192（3）：1171-1177.

［12］ Manuela T, Vesna M, Francesca C, et al. Effects of biostimulation and bioaugmentation on diesel removal and bacterial community［J］. International Biodeterioration & Biodegradation, 2012, 66：39-46.

［13］ Bregnard T, Hohener PA, Zeyer FP. Bioavailability and biodegradation of weathered diesel fuel in aquifer material under denitrifying conditions［J］. Environ Toxicol Chem, 1998, 17：1222-1229.

［14］ Aeckersberg F, Bak F, Widdel F. Anaerobic oxidation of saturated hydrocarbons to CO2by a new type of sulfate-reducing bacterium［J］. Arch Mirobiol, 1991, 156：5-14.

［15］ Rueter P, Rabus R, Wilkes H, et al. Anaerobic oxidation of hydrocarbons in crude oil by new types of sulphate-reducing bacteria［J］. Nature, 1994, 372：455-458.

［16］ Kleikemper J, Schroth MH, Sigler W, et al. Activity and diversity of sulfate-reducing bacteria in a petroleum hydrocarbon-contaminated aquifer［J］. Appl Environ Microbiol, 2002, 68：1516-1523.

［17］ 王丽萍, 刘昱慧, 邵宗泽.一株来自大西洋表层海水的烷烃降解菌Gordonia sp. S14-10的分离鉴定及其降解相关特性的分析［J］.微生物学报, 2009, 12：1634-1642.

［18］ 吴业辉, 邵宗泽.海洋烷烃降解菌Alcanivoraxsp. A-11-3的分离鉴定及其降解酶基因研究［J］.台湾海峡, 2008（5）：427-434.

［19］ 武金装, 刘红玉, 曾光明, 等.柴油降解菌的筛选及其降解特性研究［J］.农业环境科学学报, 2008, 27（5）：1742-1746.

［20］ 谢重阁.环境中石油污染物的分析技术［M］.北京：中国环境科学出版社, 1987：82-83.

［21］ 刘陈立, 邵宗泽.海洋石油降解微生物的分离鉴定［J］.海洋学报, 2005（7）：114-119.

［22］ 陈碧娥, 刘祖同.湄洲湾海洋细菌降解石油烃研究［J］.石油学报（石油加工）, 2001, 17（5）：31-35.

［23］ 谭田丰, 邵宗泽.海洋石油烃降解菌群构建及其在降解过程中的动态分析［J］.厦门大学学报：自然科学版, 2006, 45：262-266.

［24］ 苏莹, 陈莉, 汪辉, 刘兆普.海洋石油降解菌的筛选与降解特性［J］.应用与环境生物学报, 2008, 14（4）：518-522.

［25］ 周常义, 林情员, 苏国成, 等.一株海洋石油烃降解菌的分离鉴定及特性研究［J］.集美大学学报：自然科学版, 2009, 1：24-28.

（责任编辑 马鑫）

Isolation of Diesel Degrading Strain Acinetobacter sp. AK5 and Its Degrading Performance

Xu Xiaoyu Chen Jinghua
（School of Pharmaceutical Science，Jiangnan University，Wuxi 214122）

A diesel degradable bacterial strain was isolated from activated sludge and identified asAcinetobactersp. AK5 through physiological, biochemical identification and 16S rDNA sequence analysis. Experiments of the different pH values, NaCl concentrations, culture time and diesel concentrations were detected to evaluate the diesel degradability byAcinetobactersp. AK5. The results show that the optimal initial pH scope for the bacterial growth is from 5 to 9, the optimum NaCl concentrations is between 3% and 4%. When the diesel concentration is 5 g/L, the 7 d diesel degradation rate can reach 99%, while when the concentration of diesel is 20 g/L, 7 d diesel degradation rate can be 67%. TheAcinetobactersp. AK5 can grow well in artificial seawater medium and inorganic salt culture medium, therefore it has promising application prospect in seawater and freshwater oil pollution treatment.

Diesel Degradation Acinetobacter Degradation rate

2014-01-07

江苏省自然科学基金面上项目（BK2012557）

徐晓宇，女，硕士，研究方向：环境微生物；E-mail：iist@jiangnan.edu.cn