静水椎螺乙酰胆碱结合蛋白在Bac-to-Bac系统中的表达、纯化与结晶

林波 孟海玲 吴勇 邴晖 长孙东亭 罗素兰

（海南大学热带生物资源教育部重点实验室 海口市海洋药物重点实验室，海口 570228）

静水椎螺乙酰胆碱结合蛋白在Bac-to-Bac系统中的表达、纯化与结晶

林波 孟海玲 吴勇 邴晖 长孙东亭 罗素兰

（海南大学热带生物资源教育部重点实验室 海口市海洋药物重点实验室，海口 570228）

表达、纯化静水椎螺（Lymnaea stagnalis）乙酰胆碱结合蛋白（Ls-AChBP）并得到晶体。将静水椎螺乙酰胆碱结合蛋白cDNA 序列克隆到表达载体pFastBac1上，构建了重组表达质粒pFastBac1-Ls-AChBP-His，经重组子筛选，得到重组杆状病毒质粒Bacmid，采用CellfectinⅡ脂质体，把带有外源基因的杆状病毒质粒Bacmid 转染到昆虫细胞中，经镍柱和凝胶色谱柱对重组蛋白进行纯化得到五聚体，并用机器人进行结晶筛选获得其蛋白晶体。重组蛋白Ls-AChBP在Bac-to-Bac表达系统中得到高效表达并被纯化，结晶筛选得到晶体。

静水椎螺乙酰胆碱结合蛋白 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统 重组表达 纯化 结晶

烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）是配体门控的离子通道蛋白（Ligand-gated ion channel），nAChRs的研究在成瘾、神经痛、阿尔茨海默氏病，精神分裂症和帕金森氏病等疾病治疗和机理研究中具有十分重要的作用。然而到目前为止，人们尚未能清楚解析这些膜蛋白的X-ray结构。乙酰胆碱结合蛋白（AChBPs）与nAChRs的膜外配体结合结构域具有同源性，具有五聚体结构。多年来，通过AChBPs及其与配体结合的复合物的晶体结构的解析，使我们理解nAChRs的结构和功能的关系，为新药开发奠定理论基础［1-3］。

目前，已从软体动物螺里纯化与鉴别出来3种乙酰胆碱结合蛋白（AChBPs），它们的结构基本相同，分别来自静水椎螺（Lymnaea stagnalis），海兔（Aplysia californica），淡水蜗牛（Bulinus truncates），分别简称 为Ls-AChBP，Ac-AChBP和Bt-AChBP。AChBPs已经被证明与nAChRs具有相类似的配体结合结构域和相同药理特性［4-6］，所以AChBPs的晶体结构可作为研究nAChRs的工具。Ls-AChBP是三种乙酰胆碱结合蛋白中重要的一种，也是第一个被发现的AChBPs。本研究重组表达可溶蛋白Ls-AChBP，得到其晶体，旨在为研究nAChRs的结构和功能及其药理学机制提供结构模板。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、载体及基因 静水椎螺乙酰胆碱结合蛋白基因根据NCBI提供的序列（GenBank number AF364899.1）设计而成，由上海生工公司合成，并测序，在两端分别引入BamH I、XhoI酶切位点。大肠杆菌（E. coli）DH5α，转化用大肠杆菌宿主菌DH10Bac、表达载体pFastBac1、昆虫细胞Sf9（Spodoptera frugiperda）由本实验室保存。

1.1.2 酶和试剂 限制性内切酶BamH I、XhoI，PCR所用的dNTP和Taq酶，DNA Marker（DI5000），T4 DNA连接酶等为NEB公司产品。IPTG（isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷），氨苄青霉素（Ampicillin），还原剂DDT（2-巯基苏糖醇），蛋白质Marker购自上海生工公司；其他试剂均为国产分析纯。昆虫细胞培养基（Insect Xpress）购自Lonza公司、转染试剂脂质体CellfectinⅡ为Invitrogen公司产品。PEG/Ion1，PEG/ Ion2，Index，Cystal Scree，SalRX结晶池液试剂购自HAMPTON RESEARCH 公司。

1.2 方法

1.2.1 构建表达载体 Ls-AChBP基因与经限制性内切酶BamH I和XhoI双酶切后的pFastBac1载体进行连接，将鉴定正确的重组质粒pFastBac1-Ls-AChBP转化到E. coliDH10Bac中，转化产物进行蓝白斑筛选，利用白斑扩增得到Bacmid。

1.2.2 Bacmid的转染 转染前，先将处于对数生长期的大约密度为2×106个/mL Sf9细胞，均匀放置于平板中，每个孔中加入2 mL培养基，27℃静置1 h，让细胞贴壁，在显微镜下观察到细胞要80%铺满平板。同时准备以下溶液，溶液A：把5 μL重组Ls-AChBP/Bac加到100 μL的昆虫细胞培养基，混匀。溶液B：每次转染，把8 μL 脂质体CellfectinⅡ加到100 μL的培养基中，混匀。再把溶液B加入到溶液A中混合，在室温孵育30 min。弃去平板中的培养基，注意不要吸出细胞。加入2 mL培养基到脂质体CellfectinⅡ与Ls-AChBP/Bac 混合液中，混匀后移至Sf9 细胞表面，27℃培养5 h。弃去脂质体CellfectinⅡ与Ls-AChBP/Bac混合液，向细胞中加入8 mL培养基，27℃潮湿条件孵育7 d后，提取P1病毒株，把P1病毒株按1∶500扩增，5 d后获得P2病毒株，同样方法获得P3病毒株。

1.2.3 重组蛋白的表达 用P3病毒感染处于对数生长期的Sf9细胞（大约细胞密度为2×106个/mL），接种量为1∶100，摇床转速为100 r/min，温度为27℃，48 h后收获蛋白。

1.2.4 重组蛋白分离纯化和鉴定 由于蛋白为分泌表达，所以将培养基与细胞混和物3 000 r/min离心15 min后，取上清浓缩后换溶液，溶液为50 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris（pH8.0）。再高速13 000 r/min离心30 min后，挂镍柱，用300 mmol/L的咪唑冲洗。最后用凝胶色谱（AKAT，spudex200柱）纯化，流动相为50 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris（pH8.0），流速为0.5 mL/min。

1.2.5 Ls-AChBP的蛋白结晶 将纯化的Ls-AChBP浓缩至约10 mg/mL。使用坐滴蒸气扩散法在291 k长晶体。在96孔板中，用HAMPTON RESEARCH试剂PEG/Ion1，PEG/Ion2，Index，Cystal Scree，Sal tRX当池液，用机器人CRYSTAL GRYPHON（Art robbins instrusmets）点样，将浓缩蛋白与池液1∶1混合点坐滴，点样量为0.15 μL，在显微镜下观察晶体生长［8，9］。

2 结果

2.1 构建表达载体

Ls-AChBP基因N端带有前导肽，能够指导它分泌表达，前导肽的序列为MRRNIFCLACLWIVQACLS。Ls-AChBP基因C端带有6×His，有利于它的分离纯化，将带有前导肽的Ls-AChBP-His经限制性内切酶BamH I、和XhoⅠ双酶切的pFastBac1载体进行连接，得到pFastBac 1-Ls-AChBP载体（图1）。

把含载体pFastBac 1-Ls-AChBP的E. coliDH5α菌，按1∶100 的比例转接于100 mL含氨苄青霉素的培养基中，37℃振荡培养过夜，提取表达质粒。用限制性内切酶BamH I、和XhoⅠ进行双酶切再次验证。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析（图2）表明，所切下的目的片段Ls-AChBP与预期大小708 bp一致，说明表达载体构建成功。将重组质粒送上海生工公司测序，并用NCBI ORF finder分析测序结果，分析结果（图3）表明目的基因Ls-AChBP已正确插入到pFastBac 1中，开放阅读框正确。

将鉴定正确的重组质粒pFastBac 1-Ls-AChBP转化到E. coliDH10Bac中，在Heper 质粒的帮助下，pFastBac 1-Ls-AChBP质粒中Ls-AChBP基因重组到Bacmid中，产物经蓝白斑筛选，将鉴定正确的白斑菌落扩增后，用碱裂解法提取E. coliDH10Bac的质粒，并用0.5%琼脂糖凝胶电泳（图4）鉴定，Bacmid在点样口附近，Heper 质粒在中间，pFastBac 1-Ls-AChBP在最下面，约5 000 bp处。

2.2 Ls-AChBP融合蛋白在Bac-to-Bac系统中的表达与纯化

将bacmid扩增和纯化后，用脂质体CellfectinⅡ把Bacmid转染进入Sf9细胞，得到P1第一代病毒，将P1传代为P2第2代病毒，再传代为P3第3代病毒，从而获得高滴度的病毒株。用P3病毒株去感染大约密度为2×106个/mL Sf9细胞，接种比例为1∶100，27℃培养60 h后，离心收集其上清。分泌的重组蛋白Ls-AChBP的C-端带6×His标签，所以用镍柱初步纯化其上清液。

分泌表达的上清液经镍柱初步纯化后，进一步用凝胶色谱法纯化。图5-A显示Ls-AChBP的凝胶纯化色谱。Ls-AChBP的出峰位置在12.5 mL，根据Superdex200柱（GE Healthcare）的说明，峰位置为12.5 mL表示大约为130 kD的相对分子量。

从不同的峰位置A-DC收集组分作进一步的SDS-PAGE分析（图5-B）。图5-B中 A-C是重组蛋白Ls-AChBP原始状态时的SDS-PAGE胶图，SDSPAGE分析上样时，没有加还原剂和煮沸样品。RARC所示是还原状态的SDS-PAGE胶图，即上样时，加还原剂DDT和煮沸样品样5 min。

A，B，C条带在SDS-PAGE胶顶部（图5-B），显示它们原始状态形成五聚体，相对分子量约为130 kD，结果与凝胶色谱法出峰位置在12.5 mL一致。RA，RB和RC的条带在SDS-PAGE胶中，分子量约为26 kD；正好是表达出来的重组蛋白五聚体分子量的1/5，表示它们的还原状态为单体。

2.3 rLs-AChBP的蛋白结晶

将纯化的rLs-AChBP浓缩至约10 mg/mL。使用坐滴蒸气扩散法在291 k长晶体，点完晶体后，3 d观察到晶体生长出来（图6）。机器人筛选出长晶体的池液的配比如下：0.05 mol/L的柠檬酸，0.05 mol/L Bis-Tris-三丙烷，pH为5.0，16%（W/V）PEG3350。

3 讨论

已知Ls-AChBP基因cDNA 序列开放阅读框长度为690 bp（包括前导肽），编码230个氨基酸，由氨基酸序列推断的基因编码蛋白的等电点为4.9，相对分子质量为26 kD［7］。本研究将Ls-AChBP-6×His基因开放阅读框序列（708 bp，含6个组氨酸）克隆到pFastBac 1载体中，成功构建出表达质粒pFastBac 1-Ls-AChBP-6×His，转化E. coliDH10Bac，并转染Sf9细胞，纯化后得到五聚体蛋白，还原后的相对分子量约为26 kD，与预先设计的理论相对分子量相符。在构建表达载体时，将His-tag连接在Ls-AChBP蛋白序列的C-端，产生6×His融合表达载体，主要是便于利用亲和层析镍柱进行纯化，大大提高了纯化效率。Hansen等［7］在哺乳动物细胞（HEK细胞）表达了C端带有His-tag，和不带Histag的Ls-AChBP，它们也形成五聚体，通过与不同配体结合，证明了带His-tag和不带His-tag的Ls-AChBP活性相似。但是，在哺乳动物细胞里表达Ls-AChBP 容易被糖基化而不易得到蛋白晶体。

已知与nAChRs结合的激动剂和竞争性拮抗剂如乙酰胆碱，尼古丁，筒箭毒碱和α-银环蛇毒素，α-芋螺毒素等都可与AChBPs结合。AChBPs是水溶性蛋白，较易得到晶体，而且它们的晶体结构和特性与nAChRs的胞外配体结合结构域相似，具有同源五聚体结构［10-14］。本研究利用Bac-to-Bac系统成功表达了可溶性Ls-AChBP蛋白，并得到了蛋白晶体。该研究方法和结果为后续研究AChBPs与其特殊配体进行共结晶提供了前提和奠定物质基础。可以用毒素或药物泡在已得到的晶体中，或者把毒素或药物与蛋白按一定的摩尔比混合点样，可得到共同结晶体，然后收集X-ray晶体数据，分析受体-配体之间相互作用的机制及其药理学关系。为开发治疗与nAChRs相关的疾病药物设计奠定理论基础［15-18］。2014年是晶体学年，是晶体学创始人之一劳厄获得诺贝尔奖100周年，可以预期，在随后的几年里，晶体学的研究将进入一个新的高潮，AChBPs与不同的药物共结晶的研究也将是这个高潮中的一个亮点。

4 结论

成功在Bac-to-Bac昆虫表达系统中高效表达静水椎螺乙酰胆碱结合蛋白（Ls-AChBP），经镍柱和凝胶色谱柱对重组蛋白Ls-AChBP进行纯化，得到其具有活性的五聚体，并用机器人进行结晶筛选获得该蛋白晶体。

致谢：

感谢清华大学生命科学学院王新泉教授指导与帮助。

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（责任编辑 李楠）

Expression，Purification，Crystallization of Acetylcholine Binding Proteins from Lymnaea stagnalis in Bac-to-Bac System

Lin Bo Meng Hailing Wu Yong Bing Hui Zhangsun Dongting Luo Sulan
（Key Lab for Tropical Biological Resources，Ministry of Education，Key Lab for Marine Drugs of Haikou，Hainan University，Haikou 570228）

It was to construct a recombinant bacmid that expresses acetylcholine binding protein from Lymnaea stagnalis（Ls-AChBP）and express the Ls-AChBP functional genes in Bac-to-Bac expression system to obtain the crystal. Synthesized Ls-AChBP cDNA was inserted into the correct position of the baculovirus expression vector pFastBac1. After the positive recombinant bacmid was screened, the recombinant bacmid was transfected into the insect cells to generate restructured baculovirus for high expression of the recombinant protein Ls-AChBP（rLs-AChBP）, which was captured by nickel-charged resin, and further purified by gel filtration chromatography. The rLs-AChBP pentamer was obtained and performed crystallization by robot screen. Recombinant Ls-AChBP expression in Bac-to-Bac system was successfully and we got Ls-AChBP crystal. Ls-AChBP is one of the AchBPs. The crystal structure of rLs-AchBP is an available template of description of nAChRs structure and function.

Ls-AChBP Bac-to-Bac expression system Recombinant expression Purification Crystallization

2013-12-17

国家自然科学基金项目（41366002），国家国际科技合作专项（2011DFR31210），海南省社会发展科技专项（SF201328），海口市重点科技计划项目（2013-16），长江学者和创新团队发展计划（IRT1123），海南省研究生创新科研课题（B201305，B201306）作者简介：林波，男，博士研究生，研究方向：蛋白质结构；E-mail：linbo_752@163.com

罗素兰，女，教授，博士生导师，研究方向：海洋药物与生物技术；E-mail：luosulan2003@163.com；长孙东亭，男，副研究员. 研究方向：海洋药物与生物技术；E-mail：zhangsundt@163.com