非编码RNA与细菌耐药

刘翠翠，魏小娟，周绪正，李冰，牛建荣，王婧，朱阵，张继瑜

中国农业科学院 兰州畜牧与兽药研究所兽药重点开放实验室，甘肃 兰州 730050

近年来随着医疗机构的普及和抗生素的广泛使用甚至滥用，使得细菌的耐药问题日益凸现，严重影响人类的健康和畜牧业的发展。细菌耐药性也称抗药性，是细菌在适应并抵抗之前可以提供有效治疗的抗菌药物过程中产生的。细菌一旦耐药，它就会在非抗药性细菌被杀死而且没有竞争的情况下快速繁殖，抗药基因也会随之传递给下一代细菌。因此，我们要高度重视细菌的耐药问题，积极研发新型抗菌药物，并建立全球药物开发和利用的监管体系。非编码RNA在细菌的生命活动中发挥着极为广泛的调控作用，它们涉及到的功能包括从结构调节到催化作用，影响各种各样的加工过程，如质粒复制、噬菌体发育、细菌毒性、压力反应、发育控制、RNA剪切和修饰、mRNA稳定性及蛋白质降解等[1-2]。近年来，非编码RNA的疾病耐药机制也正在被阐明。

1 细菌非编码RNA

细菌基因组中存在一类新型RNA，它们的分子大小为50～500核苷酸（nt），开始于一段能折叠成稳定茎环结构的序列，终止于不依赖Rho的转录终止子[3]，能够影响生物体内的多种生理功能，被广泛称为非编码RNA。迄今在细菌中已发现了百余种非编码RNA，不同的非编码RNA发挥功能的机制不同。根据其生物学功能及作用机制，可将非编码RNA分为3类，即具有持家功能的非编码RNA、与蛋白质相互作用影响蛋白质功能的非编码RNA、与目标mRNA配对结合调控基因表达的非编码RNA[3]；根据其基因与靶标的位置关系可分为2类，即正义编码的与反义编码的非编码RNA。其中，正义编码的非编码RNA基因与靶标基因重叠，并且它们的转录体之间存在良好的碱基配对；而反义编码的非编码RNA基因与靶标基因是分离的，通常转录体之间不存在良好的碱基配对[4]。

2 非编码RNA与细菌耐药

2.1 大肠杆菌

大肠杆菌的MicF是一个93 nt的非翻译转录子，其5'端可与ompF mRNA的5'端结合形成RNA双聚体，干扰ompF基因的转录，降低ompF mRNA量，从而导致OmpF蛋白低表达，影响抗菌药物通过细胞膜，从而导致耐药。膜孔蛋白OmpF是重要的抗菌药物通透蛋白。李俐[5]等对临床菌株进行了MicF的检测，分析其与耐药的相关性，结果显示实验组的MicF转录水平普遍高于对照组，说明MicF通过干扰膜孔蛋白的表达对细菌耐药起着调控作用。Warner等[6]也证实MicF与大肠杆菌的抗生素耐药有关，同时发现大肠杆菌中的marRAB操纵子可以通过调节多药耐药泵AcrAB-TolC的表达来使细菌产生耐药性。

大肠杆菌的DsrA是一个87 nt的非编码RNA，可以通过反作用H-NS调节因子的转录抑制和激发RpoS σ因子的合成来调节靶基因的表达[7]。尽管对DsrA调控网络的主要部分已进行了研究，但它与耐药性之间的关系仍然未知。2010年，Nishino等[8]证实，大肠杆菌中DsrA通过上调mdtEF外排泵的表达，降低了大肠杆菌对苯唑西林、氯唑西林、红霉素、罗丹明6G和新生霉素的敏感性；DsrA的过表达使得mdtE的表达明显上调，而由DsrA调节的多药耐药性的降低也依赖于mdtEF外排泵。

2.2 伯克霍尔德菌

伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）是一种广泛存在于水、土壤、植物和人体中的革兰阴性细菌。Ramos[9]等运用生物信息学技术，对伯克霍尔德菌中的非编码RNA MtvR（136 nt）进行了靶基因预测，显示它共有309个mRNA靶标，当MtvR沉默或过表达时，17～19个mRNA基因受到影响。研究证实，MtvR在抗生素耐药性方面有重要的调节作用。MtvR沉默的伯克霍尔德菌株与正常菌株相比，最低抑菌浓度（MIC）略有不同，但这些微小的变化没有改变细菌的耐药或敏感状态。与此不同的是，MtvR过表达的伯克霍尔德菌株能够改变菌株的易感性，尤其是对氨基甙类的庆大霉素、阿米卡星和β-内酰胺类的头孢他啶、亚胺培南的易感性。

2.3 沙门菌

沙门菌是革兰阴性肠道杆菌，能够引起人和动物的胃肠炎、伤寒及败血症等。Yu等[10]用老虎霉素和四环素诱导沙门菌，发现有4个非编码RNA（sYJ5、sYJ20、sYJ75和sYJ118）明显上调，而且当老虎霉素存在时，sYJ20缺失可以导致细菌生存能力降低，补充sYJ20之后恢复。说明非编码RNA可以影响细菌对抗生素的反应。基因组分析显示，sYJ5和sYJ118在16S和23S rRNA基因间区编码；sYJ20（也称作SroA）在tbpAyabKyabJ操纵子的上游编码，是一类核糖开关；sYJ75也在基因间区编码，与肠杆菌素的运输和代谢有关。

2.4 金黄色葡萄球菌

宋娟等[11]分别在不同抑菌浓度左氧氟沙星干扰情况下培养金黄葡萄球菌实验株RN6390和RN1HG001，提取RNA，用实时定量逆转录PCR（qRT-PCR）检测不同菌株中5种小分子RNA（sRNA）（RNAⅢ、RsaA、RsaE、RsaG、RsaH）的含量，发现不同浓度的左氧氟沙星对金黄葡萄球菌sRNA的表达具有抑制或促进作用。Benjamin等[12-13]采用万古霉素、利奈唑胺、头孢吡普和老虎霉素诱导细菌产生耐药性，并以未添加抗生素的细菌为对照，然后进行RNA-seq和非负矩阵分解（non-negative ma⁃trix factorization，NMF）分析。结果显示5个sRNA有差异表达，包括基因调节系统的效应分子RNAⅢ下调表达，还有假定的sRNA260和通过实验验证的RNA131（也称RsaOI）都上调表达。这些数据为sRNA与葡萄球菌抗生素耐药性的关系研究提供了一个框架，同时探索了一条新的与sRNA相关的抗菌疗法。

2.5 鼠疫耶尔森菌

鼠疫耶尔森菌是鼠疫的病原，为革兰染色阴性的短小杆菌，能引起淋巴腺鼠疫（黑死病），病亡率高达90%。邓仲良等[14]对肠杆菌科基因组序列进行分析发现，大多数基因组内只存在1个RyhB，只有耶尔森菌和沙门菌基因组内存在2个RyhB同源拷贝，其中一个拷贝可能是进化分支过程中获得的。鼠疫耶尔森菌的RyhB1和RyhB2都位于染色体上，且相距较远。蛋白质组学技术分析表明RyhB1和RyhB2在调控中的作用是不同的，RyhB2发挥主要的调控作用，并且主要调控小分子代谢物（8个），如糖酵解、丙酮酸脱氧酶和铁摄取等，占到总蛋白的50%。令人感兴趣的是，RyhB2还能上调一个多耐药相关的蛋白acrA，acrA是多耐药流出泵家族一员，而多耐药流出泵在参与革兰阴性菌耐药中发挥重要作用。

3 结语

细菌耐药性是细菌对抗生素不敏感的现象，是细菌在自身生存过程中的一种特殊表现形式，有些细菌甚至携带数种耐药基因，被称作多重耐药菌或超级细菌，这使得开发新型药物迫在眉睫[15-16]。非编码RNA作为一种新的调控子，不仅在个体发育过程中发挥重要作用，也在疾病发生和治疗中担任着不可忽视的角色，已成为国际上的研究热点。目前有关抗生素与细菌非编码RNA相互作用与影响的研究报道较少。我们初步总结了几种细菌的非编码RNA与其耐药性之间的关系，为探索非编码RNA功能和解决耐药问题奠定基础。

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