金黄色葡萄球菌生物膜形成机制研究进展

胡晓丰，史云，戚丽华，王勇，宋宏彬，张传福，刘雪林

军事医学科学院 疾病预防控制所，北京 100071

细菌生物膜（biofilm，BF）是指细菌在生长过程中附着于非生物或生物表面、由自身产生的胞外聚合物及其基质网包裹的有三维结构的菌细胞群体[1]，它可保护细菌不受抗菌药物的作用，并能降低机体免疫功能和细胞的吞噬作用[2]。金黄色葡萄球菌是一种重要的致病菌，可引起许多严重感染，现已成为细菌性食物中毒、医院和社区获得性感染最常见的病原菌之一[3]。金黄色葡萄球菌可依靠其黏附在医疗植入物或组织表面形成生物膜，从而导致生物膜病（biofilm associated diseases）的产生[4]。近年来高分子材料制成的医疗植入物应用广泛，由于人口老龄化及免疫低下人群的增多，金黄色葡萄球菌导致的生物膜相关性疾病患病率逐年上升。至今尚无药物能有效控制这类感染，一旦发生金黄色葡萄球菌生物膜感染，难以彻底治愈。深入研究金黄色葡萄球菌生物膜形成的分子机制和调控网络，对寻找有效的防治、治疗药物和手段具有重要意义。我们就金黄色葡萄球菌生物膜形成过程、调控机制的最新进展做简要综述。

1 金黄色葡萄球菌生物膜的形成过程

金黄色葡萄球菌生物膜的形成过程大致可分为4个阶段：黏附、聚集、成熟和脱落。金黄色葡萄球菌首先须非特异性黏附于医疗植入物或组织表面，黏附细菌在增殖的同时合成多种胞外多聚物[5]；借助胞外多聚物，细菌间相互黏附并聚集[6]；而后细菌生成的生物膜逐渐成熟稳定，成熟的生物膜含有胞外多糖黏附分子、蛋白质、磷壁酸及胞外DNA等；生物膜成熟后，细菌合成的酚溶性调节肽等物质可能介导菌细胞从生物膜脱落进入血流，引起菌血症或在其他部分引发新感染灶。在生物膜形成过程中，金黄色葡萄球菌能够分泌包括聚集相关蛋白（Aap）和数种非共价结合的表面蛋白等约20种LPXTG类“识别黏附基质分子的微生物表面组分（microbial sur⁃face components recognizing adhesive matrix mole⁃cules，MSCRAMM）”，可与机体细胞外基质蛋白如纤维蛋白原等结合[7-8]。

2 金黄色葡萄球菌生物膜形成的调控机制

2.1 胞外多糖黏附因子与金黄色葡萄球菌生物膜的形成

胞外多糖黏附因子（polysaccharide intercelluar adhesion，PIA）是革兰阳性细菌生物膜基质网的重要组成部分，是由相同的单体D-葡萄糖胺通过β-1，6糖苷键相连的不分叉的多聚体。在形成生物膜的金黄色葡萄球菌中，部分菌株的ica操纵子与生物膜形成能力密切相关。研究发现，包含一个调节基因icaR和4个功能基因（依次为icaA、icaD、icaB、icaC）的ica操纵子在生物膜形成等厌氧环境下基因表达水平上调，是生物膜形成所必需的操纵子；icaADBC基因簇的表达可促进PIA的合成，且PIA在金黄色葡萄球菌生物膜形成过程中发挥重要作用[9-10]。还有研究发现部分金黄色葡萄球菌ica操纵子阴性，不能形成PIA，但仍可形成生物膜[11]。因此，Archer等[2]提出了PIA依赖的金黄色葡萄球菌生物膜形成途径和PIA非依赖的金黄色葡萄球菌生物膜形成途径。

对于PIA依赖的金黄色葡萄球菌生物膜形成途径，Jefferson等[12]研究发现icaR通过结合到ica的启动子区域对其进行了很强的负调控，敲除icaR后可导致ica表达水平增高，而tcaR和icaR是金黄色葡萄球菌的ica基因簇的转录抑制剂[13]。由此，可通过tcaR和icaR抑制icaADBC的表达来减少PIA的合成，从而减弱生物膜形成的能力。生物膜形成的调控子Rbf可通过间接抑制icaR的转录上调ica表达水平，促进PIA的生成，从而增强金黄色葡萄球菌生物膜形成的能力[14]；而clpP突变和clpX突变的抑制基因（suppressor of clpP and clpX mutations，Spx）负调控金黄色葡萄球菌生物膜形成，通过间接促进icaR转录来下调icaADBC表达，减少PIA的生成，从而减弱生物膜形成的能力[15]。此外，Ulrich等[16]发现，双组分信号转导系统SrrB/SrrA通过结合到icaADBC操纵子上游100 bp的DNA序列，在厌氧条件下上调icaADBC操纵子表达而促进PIA的生成。由此可推断，SrrB/SrrA在厌氧条件下可通过上调icaADBC基因簇表达，促进PIA的生成，从而增强PIA依赖的金黄色葡萄球菌生物膜形成的能力。

在PIA非依赖的金黄色葡萄球菌生物膜形成途径中，主要是细胞外基质蛋白如蛋白A（SpA）和生物膜相关蛋白（Bap）等发挥主要作用。Merino等[17]发现，在ica缺失的金黄色葡萄球菌中，生物膜能够在SpA缺失突变体中通过外源加入SpA回补表型形成，说明SpA在不锚定到细胞壁上的情况下仍能增强金黄色葡萄球菌生物膜形成的能力。Lasa[18]等发现，金黄色葡萄球菌中具有高分子量、位于细菌表面的Bap和Bap相关蛋白，可不依赖于PIA而通过增加细胞间的聚集促使生物膜形成。此外，纤连蛋白结合蛋白（FnBP）通过自溶素和SigB调节，也可以促进生物膜的形成[19]。值得提出的是，O'Neill等[20]在2007年研究发现，在把icaADBC操纵子缺失的突变体按照甲氧西林敏感性分类的情况下，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）能够形成生物膜，而甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）的生物膜形成受损。以上研究表明，细胞外基质蛋白细胞和细胞间的黏附能够以不依赖ica的生物膜形成模式替代PIA依赖的金黄色葡萄球菌生物膜形成，即存在PIA非依赖金黄色葡萄球菌生物膜形成途径。但对于ica操纵子缺失的MRSA和MSSA，目前研究人员还不能明确它们形成生物膜能力不同的原因。

2.2 胞外DNA与金黄色葡萄球菌生物膜的形成

金黄色葡萄球菌可通过多种方式释放胞外DNA（eDNA），为生物膜形成提供支持。eDNA在金黄色葡萄球菌生物膜形成的初始阶段有助于细菌黏附到有机物表面及细菌间黏附，它在金黄色葡萄球菌黏附到高分子多聚物材料表面的初始阶段发挥重要作用。在成熟生物膜中，eDNA作为结构成分对生物膜起稳定作用，它借助其大分子结构，能够在生物膜中连接其他分子（尤其是蛋白质和PIA），从而增强金黄色葡萄球菌生物膜形成能力[7]。

金黄色葡萄球菌eDNA与生物膜形成的调节机制比较复杂[2]。Whitchurch等[21]首次在铜绿色假单胞菌中发现eDNA是形成生物膜的重要组分。研究发现，皮肤细胞上的DNA酶能减少生物膜形成，通过DNA酶处理可降解eDNA并减弱eDNA介导生物膜形成的能力[21-23]。金黄色葡萄球菌的cid和lrg操纵子通过控制细菌裂解和DNA释放参与生物膜的形成[24-25]。Rice等[24]发现，活性基因cidA的缺失可以导致细菌裂解和生物膜附着的减少，同时使得这些生物膜中的eDNA量减少。也就是说，cidA基因具有裂解细菌的功能，可导致eDNA释放增多，从而增强生物膜的形成能力。lrg基因上调可抑制细菌自溶，导致eDNA释放减少，从而减弱金黄色葡萄球菌生物膜的形成能力[25]。cid和lrg操纵子均具有调节黏肽水解酶的活性，有研究显示cid和lrg操纵子编码蛋白的功能与噬菌体的孔蛋白和孔蛋白拮抗蛋白类似，调节细菌产生的胞壁水解酶活性和细菌的裂解/死亡，从而影响生物膜的形成。此外，Jeffrey等[26]发现金黄色葡萄球菌altA基因编码的自溶素（AtlA）可能通过促进eDNA的释放增强生物膜的形成能力。以上研究表明，控制细胞裂解和eDNA释放是金黄色葡萄球菌生物膜调控机制中的重要环节。

2.3 密度信号感应系统与金黄色葡萄球菌生物膜的形成

密度信号感应系统（quorum sensing system，QS）是指细菌细胞密度依赖的细胞间信号基质，可以协调细菌特定基因的表达，有利于细菌适应环境压力。在金黄色葡萄球菌中，辅助基因调节（acces⁃sory gene regulator，agr）系统和 luxS/AI-2系统是目前已发现的密度信号感应系统中最主要的2个，并在生物膜形成的不同阶段发挥作用。

2.3.1 agr系统 研究发现金黄色葡萄球菌的agr系统通过上调解离因子、下调定殖因子而抑制生物膜的形成[27]。Boles等[28]发现金黄色葡萄球菌agr缺失突变株形成生物膜的能力强于其野生型，agr系统促使已建立完整的生物膜解离。此外，向成熟的生物膜中加入自诱导肽（AIP）可以促进生物膜解离，这可能是由于agr缺失使得许多参与生物膜解离的基因（如核酸酶、蛋白酶基因等）表达水平下降导致的。此外，agr系统可以通过上调类似去污剂的多肽和核酸酶的表达来促进生物膜的解离[29]。对于定殖因子的基因调控，金黄色葡萄球菌agr系统通过抑制MSCRAMM表达来发挥作用[30]。Clp蛋白酶（ClpP）也与生物膜形成有关，clpP基因敲除后生物膜形成能力增强，agr基因敲除株中ClpP的表达量显著提高，提示clpP基因的转录可能受agr系统的调控[31]。

2.3.2 luxS/AI-2系统 LuxS是细菌硫代谢中参与甲基循环的代谢酶之一，催化合成自诱导信号分子Autoinducer-2（AI-2）。AI-2广泛存在于大多数细菌中，目前被认为是惟一能进行种内和种间交流的“通用语言”[32-33]。对金黄色葡萄球菌中luxS/AI-2系统功能的研究目前存在争议，Doherty[34]等在Newman株中敲除了luxS基因，发现并未影响其毒力和生物膜形成能力，推测在金黄色葡萄球菌中luxS基因与群体感应无关；而Kuehl[35]等在Newman株培养基中加入亚抑菌浓度的呋喃酮，发现luxS的表达受到抑制，而生物膜形成能力大幅增强。还有研究发现luxS系统通过参与调控金黄色葡萄球菌荚膜多糖的合成来增强生物膜的形成能力[36]。luxS的代谢作用目前已被证实[32]，但luxS/AI-2系统在金葡菌生物膜形成中的角色还没有被阐释清楚。

2.4 全局性调控因子与金黄色葡萄球菌生物膜的形成

目前发现在金黄色葡萄球菌中调控生物膜形成的全局性调控因子（global regulators）包括葡萄球菌辅助调节子（staphylococcal accessory regulator A，SarA）、转录因子sigma B（SigB）等，对金黄色葡萄球菌生物膜的形成发挥重要的调控功能。

2.4.1 辅助调节子SarA sarA是除agr外细胞壁黏附和外毒素等毒力因子的另一个重要调控基因，芯片研究发现sarA至少调控120个基因的转录[7]。sar操纵子由sarA及3个启动子（P1、P2、P3）和2个开放读框（ORF2和ORF4）组成，3个启动子能够转录含重叠区域的sarA、sarC和sarB转录产物。sarA通过抑制核酸裂解和胞外酶来促进黏附和早期的生物膜形成，与浮游态相比，金黄色葡萄球菌在生物膜状态下sarA的转录表达水平上调[37]，且sarA缺失突变株形成生物膜的能力减弱[38]。此外，研究发现金黄色葡萄球菌sarA缺失突变株生物膜形成能力可通过突变耐热核酸酶或增加蛋白酶抑制剂的基因编码而恢复，阻碍了eDNA等生物膜形成重要组分的降解，从而恢复生物膜形成的能力[39]。

sarA可能以不依赖agr的方式调控生物膜的形成[40]，而sarA的转录依赖于sigB[41]。另有研究发现，金黄色葡萄球菌PIA的合成必须有sarA存在，它与icaA的启动子序列有很高的亲和力，sarA还能正调控Bap的表达。此外，在部分金黄色葡萄球菌中，对受sarA调控的alsSD基因进行突变可影响生物膜的形成能力[7]。

2.4.2 转录因子SigB SigB可上调金黄色葡萄球菌生物膜形成早期所必需的因子，包括聚集因子、纤连蛋白结合蛋白A（FnBPA）和凝固酶[42-43]。除此之外，与生物膜解离相关的因子，包括β-溶血素、内毒素B、丝氨酸蛋白酶（SplA）、半胱氨酸蛋白酶（SplB）、金属蛋白酶（Aur）、属半胱氨酸蛋白酶A（SspA）和白细胞毒素D，都受到SigB的负调控[44]。有研究发现，金黄色葡萄球菌sigB缺失突变株RNAⅢ的转录水平被上调，且不能形成生物膜[45]；还有研究发现sigB缺失突变株RN6390失去了形成生物膜的能力，证实sigB正调控金黄色葡萄球菌生物膜的形成，并发现敲除agr或添加蛋白酶抑制剂可以恢复其形成生物膜的能力[46]；但Valle等[37]发现sigB的缺失突变株仍然能形成生物膜。根据这些相反的研究结果，推测sigB可能是以一种菌株特异性的形式调控生物膜的形成。

2.5 双组分信号转导系统与金黄色葡萄球菌生物膜的形成

双组分信号转导系统（two-component signal transduction systems，TCS）是在原核生物界广泛存在且保守的一类系统，主要负责应对环境压力，调控细胞的反应。随着细菌基因组测序工作的不断进行，研究人员已在145个已测序的细菌基因组中发现了4000多个TCS，其中金黄色葡萄球菌中存在16对TCS[47]。目前在金黄色葡萄球菌中发现的与生物膜形成相关的TCS包括YycG/YycF、SaeS/SaeR、SrrB/SrrA、ArlS/ArlR、LytS/LytR。

金黄色葡萄球菌生存所必需的YycG/YycF的表达水平与其生物膜形成能力呈正相关[48-49]。SaeS/SaeR这一TCS参与金黄色葡萄球菌生物膜形成的调节[50]，在金黄色葡萄球菌胞外蛋白活化途径中sae位于agr下游，其突变能上调agrA表达，从而影响金黄色葡萄球菌生物膜的形成。SrrB/SrrA于2001年被发现存在于金黄色葡萄球菌中[51]，它可直接抑制agr系统的作用[52]，在厌氧状态下可以刺激金黄色葡萄球菌ica操纵子的转录及PIA的合成，从而有利于生物膜的形成[53]。ArlS/ArlR是在金黄色葡萄球菌转座突变体的研究中发现的[54]，金黄色葡萄球菌alsS/R缺失突变株的生物膜形成能力增强[55]。此外，sarA和agr QS系统可对ArlS/ArlR进行调节[56]。研究发现金黄色葡萄球菌lytS/R基因缺失突变株的生物膜形成能力增强，表明LytS/LytR在金黄色葡萄球菌生物膜形成过程中发挥重要作用[57-58]。

综上所述，金黄色葡萄球菌生物膜形成过程和调控存在错综复杂的基因网络，机制至今未能阐明。因此，需要更加深入探索金黄色葡萄球菌生物膜形成各阶段的调控机制，从而针对其生物膜形成的不同环节制定不同的抗生物膜策略。

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