腺病毒疫苗研究进展

王芃，周建光

军事医学科学院 生物工程研究所，医学分子生物学实验室，北京 100850

腺病毒是一种无包膜的双链DNA病毒，相对分子质量为1.5×108，直径约为95 nm，是已知最大和最复杂的无包膜DNA病毒之一。每个腺病毒均由外部的衣壳蛋白和内部的核心蛋白组成。核心蛋白包括蛋白Ⅴ、Ⅶ和Ⅹ，它们与病毒基因组结合；末端蛋白TP与病毒DNA的5'端共价结合；围绕着病毒核心的是病毒的衣壳，它是由7种蛋白（Ⅱ、Ⅲ、Ⅲa、Ⅳ、Ⅵ、Ⅷ和Ⅸ）通过非共价相互作用形成的二十面体对称结构，其中240个三聚六邻体（蛋白Ⅱ）是该20面体的主要组成蛋白。人类的腺病毒目前已鉴定出53个血清型，根据它们的血凝反应、对啮齿类动物的致瘤性、DNA的同源性和基因组的结构，分为A、B、C、D、E、F、G亚属，B亚属又分为B1和B2组[1]。各个亚属的腺病毒的致病性是不同的，B1、C和E亚属引起呼吸道感染，B2亚属引起肾脏和泌尿道的感染，F亚属引起胃肠炎，D亚属的部分血清型与流行性角膜结膜炎有关。

1 国内外腺病毒疫苗研究进展

1.1 国外研究进展

在近50年的时间里，腺病毒是美军现役军人尤其是基层受训官兵重症呼吸道疾病的主要病原体，而其中4型和7型腺病毒是主要的感染血清型。鉴于此，1971～1996年，美国国防部联合国家卫生署和Wyeth公司开发了口服4型和7型腺病毒疫苗，经胃肠给药途径可以激发受试者血清抗体，多年接种结果证实该疫苗是安全的，没有观察到病毒间的交叉反应，而且该疫苗项目的接种实施在军队中显著降低了腺病毒的致病和死亡人数。然而自从该疫苗接种项目结束后，腺病毒造成的死亡人数又重新回升，因此2011年腺病毒疫苗接种项目又重新启动[2-3]。对4型和7型腺病毒的疫苗株和原型株的基因组测序、生物信息学分析和比对已经完成[4-6]。基因组的进化分析表明，E属4型腺病毒的原型株在进化树上与黑猩猩腺病毒有着较近的亲缘关系，而与其他已知腺病毒的亲缘性较远，它可能起源于一系列由黑猩猩传染到人的人畜共患病事件；4型腺病毒疫苗株的基因组与原型株相差不大，有6个位点的非配对和4个位点的插入缺失，7型腺病毒疫苗株和原型株相比有611个位点非配对和130个位点插入缺失。

4型和7型腺病毒疫苗的安全性已在大量美军人群中得以验证，研究者又对它们作为外源抗原呈递载体进行了尝试。最初将它们用来表达乙肝病毒抗原，将包含乙肝抗原表位gp27和p24的表达盒子插入腺病毒的末端序列区，在A549细胞系中这些乙肝抗原得到了较好的表达，将表达乙肝抗原的重组7型腺病毒对狗进行免疫后，获得了针对乙肝抗原和7型腺病毒的较高的血清阳转率[7]，说明用这2种疫苗株表达外源抗原的思路是可行的。随后针对在人群中具有较快传播速率和较高致死率的流感病毒H5N1，将其凝血素基因HA替换并插入4型腺病毒疫苗的E3区，得到了重组腺病毒流感疫苗Ad4-H5-Vtn，经小鼠鼻饲免疫后可引发特异性的体液和细胞免疫，并在致死剂量的H5N1攻击小鼠时对动物起到了保护作用[8]。随后，研究者对该疫苗进行了临床Ⅰ期试验，将Ad4-H5-Vtn进行了间隔56 d的3次口服免疫，最后受试者接受了90 μg灭活H5N1疫苗的肌肉注射加强免疫，实验结果表明口服高滴度Ad4-H5-Vtn的受试人群血清全部转为抗HA阳性，说明通过口服该疫苗可以增强HA抗体的产生，克服现有灭活流感病毒疫苗免疫效果不佳的缺陷[9]。

1.2 国内研究进展

在我国的流行病学调研中，腺病毒在人群尤其是少年儿童中引发的感染主要为急性呼吸道感染疾病和肺炎，我国流行的腺病毒肺炎多数由3型及7型腺病毒引起，并且临床上7型重于3型。近年来，周荣研究团队对3型和7型腺病毒疫苗的构建做了一系列尝试。首先，他们构建了E1区缺失的复制缺陷型3型腺病毒，又构建了可以表达E1蛋白的HEp2细胞系HEp-2/E1，将E1缺陷的3型腺病毒转染到HEp-2/E1中，出现了典型的病毒感染导致的细胞病变效应（CPE），并观察到了报告基因绿色荧光蛋白的表达[10]。然后，他们运用细菌的同源重组机制，将全长3型腺病毒构建在质粒上，使其可以在大肠杆菌中稳定存在，并可以在体外通过同源重组或传统的基因克隆的方法方便地实现对3型腺病毒基因组的改造，通过这样的方法将GFP基因插入腺病毒的E3区，证明GFP可以表达，将这种重组3型腺病毒通过肌肉注射、灌胃和鼻饲三种途径免疫小鼠，均可以在小鼠体内引发针对eGFP的特异抗体[11]。这2项研究证明了3型腺病毒作为减毒疫苗和外源抗原呈现载体的可能性。为了研制3型和7型双价腺病毒疫苗，周荣等通过生物信息学方法预测了3型和7型腺病毒的位于六邻体高变区（HVR）的各4个中和表位，并构建了8种嵌合型腺病毒载体，为双价疫苗的研制奠定了基础，并表明3型腺病毒的六邻体高变区是病原体表位呈现的良好靶点[12]。随后研究者将手足口病毒EV71衣壳蛋白上的15个氨基酸的表位SP70整合到3型腺病毒的六邻体的高变区上，动物实验表明SP70重组腺病毒可以引发高滴度的IgG抗体，并使动物对EV71病毒具有保护作用[13]。以上研究结果表明，我国在3型和7型腺病毒疫苗的研究上已有一定深度，并在积极拓展其在抗原呈递载体中的作用。

2 以腺病毒为载体的疫苗

2.1 腺病毒作为抗原呈递载体的优势

腺病毒本身既可作为疫苗，也可作为外源基因递送载体。腺病毒作为基因递送载体的优势包括：①宿主范围广，对人致病性低，不整合到染色体中，无插入致突变性；②对增殖和非增殖细胞都可以感染；③腺病毒重组载体的构建和在悬浮细胞中的大规模培养已有较成熟的技术路线，而且成本低廉，病毒滴度高[14-15]；④与人类基因组同源；⑤在不同的剂型配方下，腺病毒载体疫苗可在4℃液体缓冲液中保存[16]，或以冻干粉形式存在1年以上[17]，而新近研究出的热稳定技术可以使腺病毒载体在高达45℃的室温下保存6个月而其侵染活性少有下降[18]；⑥腺病毒自身具有免疫佐剂的功能，可以激发机体天然免疫反应[19]，因此更加易于操作并能够降低生产成本；⑦腺病毒载体疫苗可以有多种给药途径[20-23]，它可以侵染不同类型的细胞和组织，可以侵染分化和未分化细胞，甚至包括抗原提呈细胞[24]。

5型腺病毒是常见的用于疫苗构建和基因治疗的载体，基于5型腺病毒重组载体的研究经历了大致3代的完善。第一代腺病毒载体是将E1或E1和E3片段同时缺失，该类型腺病毒可容纳高达8 kb的外源基因，是目前各种腺病毒载体中应用最广的；第二代腺病毒载体是在第一代缺失E1或E3基因的基础上进一步将E2和E4基因缺失掉，从而降低载体的毒性，增加其外源基因的装载容量，提高其在细胞内的表达水平，但E2或E4区编码的蛋白对细胞有害，从而难以建立反式提供E2或E4区编码蛋白的稳定细胞株，导致重组病毒的制备比较困难，因此限制了其应用；第三代腺病毒载体是辅助病毒依赖性的腺病毒载体（HDAd），它除了保留有病毒必需的顺式作用元件外，其余几乎所有的病毒编码序列都缺失掉了。尽管第二代和第三代的腺病毒载体避免了抗载体免疫反应，并且具有更优的免疫效果，但它们在大规模生产和临床应用上还存在很多困难。

2.2 腺病毒载体存在的主要问题和解决方案

腺病毒用于疫苗构建时面临的最大问题就是预存免疫（pre-existing immunity）的存在，即由于5型腺病毒在环境中很常见，人群中容易产生抗腺病毒的免疫反应，而这将会极大地降低腺病毒载体疫苗在人体中的效价。人们想出了很多策略来克服预存免疫的问题，这些策略包括两大类：一类是化学法，即用聚乙二醇（PEG）等化学试剂包裹腺病毒，屏蔽其抗原表位，从而逃逸宿主的免疫作用，但此类方法难以获得高滴度的病毒，在实际应用时有较大难度；另一类就是采用基因工程的方法对腺病毒进行修饰，这些方法主要包括构建嵌合体修饰的5型腺病毒衣壳、构建嵌合型的腺病毒、将基于5型腺病毒的疫苗完全替换为其他稀有的（来自人类或非人类的）腺病毒血清型。为了应对人体已有的免疫原性，出现了一批5型腺病毒载体的替代品，包括基于稀有血清型人腺病毒（如Ad11、Ad26、Ad35、Ad48、Ad49、Ad50等）和非人类腺病毒载体如大猩猩Ads、牛Ad3、狗Ad2、猪Ad3等。但有数据表明，不管是来源于稀有人血清型的腺病毒载体还是大猩猩的腺病毒载体，其所带的外源基因引发的特异性抗体反应强度均显著低于由5型腺病毒载体[25-27]携带所激发的免疫反应。并且，由于已感染5型腺病毒而存在的特异的CD4+和CD8+T细胞对于大猩猩重组腺病毒疫苗效价的发挥仍有不利的影响[28-29]。

2.3 将外源抗原呈现在腺病毒衣壳的研究进展

六邻体是腺病毒衣壳中含量最高的蛋白，也被认为是中和抗体的主要靶点。在克服预存免疫的策略中，很多都是针对六邻体进行设计的。最初的设计通过将5型腺病毒的六邻体基因替换为3型腺病毒的六邻体，该嵌合型腺病毒可以在293细胞中进行包装复制，并且用其感染小鼠后可以避免5型腺病毒预存免疫的影响，但这种嵌合型5型腺病毒的缺点在于与野生型相比它的复制速率降低，而且病毒滴度下降了一个数量级[30]。在六邻体蛋白三聚体结构的塔尖区域中有7个HVR，包含型特异性表位。针对此，设计了一种新型的5型腺病毒嵌合型载体，其中位于5型腺病毒六邻体的7个HVR被相应的来自罕见血清型腺病毒Ad48的HVR所代替，这种HVR嵌合型的5型腺病毒载体可进行高滴度的包装并在体外稳定传代；在裸鼠和恒河猴的实验中，用这种新型嵌合型载体表达猴免疫缺陷病毒（SIV）的Gag抗原与母本腺病毒载体相比具有相似的免疫原性，而且在高水平的抗5型腺病毒免疫预存存在时，没有观察到嵌合型载体的外源抗原免疫原性下降，然而母本腺病毒载体的抗原免疫原性则被抑制了。该研究证明构建六邻体HVR区的嵌合体腺病毒载体是克服预存免疫的有效方法[31]。

五邻体是腺病毒衣壳的重要组成部分，它们组成了衣壳的顶角并与六邻体和纤毛蛋白相互作用。五邻体的2个高变的环区暴露于衣壳表面，在不同的腺病毒血清型中，一个称为高变区1（HRV1 loop），另外一个因具有与腺病毒次级受体整合素结合的RGD motif而被称为RGD loop，不同血清型腺病毒的HVR1和RGD loop的长度都有明显的变化。实验证明五邻体上的这些环区的表位是除六邻体外又一个有重要意义的靶点，对这些区域进行修饰，可以改变腺病毒的组织嗜性[32]。

腺病毒的12根纤毛的近端在二十面体腺病毒的十二顶点处插入五邻体基座，其远端纤毛突起形成球状结构域，该纤突位点是与细胞受体的主要作用位点。有研究证明，经免疫接种和自然免疫获得的5型腺病毒的中和抗体同时靶定于六邻体和纤毛上，对免疫接种小鼠、免疫接种人群和自然暴露人群的血清实验发现，针对腺病毒宿主产生的中和抗体中很大一部分是针对六邻体的，但也有一部分是靶向纤毛的。鉴于此，研究者将5型腺病毒的六邻体7个HVR区和纤突区都替换为黑猩猩腺病毒AdC68的相应基因片段，由此构建的新型嵌合型5型腺病毒载体经体外和体内实验证明，几乎可以完全逃逸5型腺病毒特异的中和抗体[33]。为进一步探索将腺病毒纤毛蛋白作为抗原展示位点的可行性，研究者将铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF的14个氨基酸的第8表位Epi8展示在5型腺病毒的5个不同的纤毛位点（loopCD、loopDE、loopFG、loopHI、纤毛的C端）上，以及六邻体第5 HVR的环区，并与将全长OprF表达在5型腺病毒上的重组载体相比较。将这些疫苗候选株肌肉注射免疫小鼠后，发现构建于loopFG和loopHI的腺病毒疫苗候选株可以激发最强的抗OprF的体液免疫和细胞免疫反应，并且在5型腺病毒预存免疫存在时，基于loopFG和loopHI的腺病毒疫苗株依然可引发对铜绿假单胞菌的免疫保护作用[34]，这说明将抗原表位整合在腺病毒的纤毛区是一种可行的疫苗设计策略。

以六邻体、五邻体和纤毛作为修饰靶点构建疫苗候选株虽然得到了较好的体内和体外的免疫效果，但囿于这些位点临近区域的序列和结构保守性，因此只能展示最大不超过100个氨基酸残基的线性表位。近年来的研究表明，用腺病毒衣壳上的辅助小蛋白Ⅸ作为展示平台，可以表达1000个氨基酸残基的外源抗原。蛋白Ⅸ在腺病毒的每个壳面存在12个拷贝，可稳定六邻体蛋白间的相互作用，是病毒包装的必需成分。研究者将单纯疱疹病毒胸苷激酶HSV-TK联合萤光素酶构建在腺病毒的蛋白Ⅸ区，通过正电子发射断层显像技术（PET），在体外和体内实验中证实了萤光素酶的表达[35]。然后，又有研究者将比较大的肽段如单链抗体（scFV）和单域抗体（sdAB）表达于腺病毒蛋白Ⅸ的C端，从而实现了腺病毒的重定位，但该研究者指出，在scFV表达时，由于蛋白无法正确折叠会影响其功能的发挥[36]。在用于疫苗的研究方面，研究者将泡沫病毒（FV）的包膜蛋白gp70与5型腺病毒的蛋白Ⅸ相融合，使gp70不仅可以呈现在病毒载体表面，并且可在体内实现它的表达，实验结果发现这种将呈现和体内表达相结合的疫苗设计，可以使受试小鼠中和抗体滴度和CD4+T细胞反应增强[37]。

综上所述，六邻体的HVR区是引发腺病毒型特异性中和抗体结合的主要靶点，在针对腺病毒的预存免疫进行应对策略和构建多价腺病毒疫苗时，对该区域的基因修饰是不二选择；五邻体的2个高变区HVR1 loop和RGD loop，以及纤毛的HI loop和C端是进行抗原表位展示的理想靶点；在插入多肽抗原和分子较大的外源蛋白时可以尝试辅助蛋白Ⅸ位点。有研究者将流感病毒血凝素HA表位分别整合在5型腺病毒载体衣壳的六邻体HVR5区、五邻体的RGD loop、纤突的HI loop和蛋白Ⅸ的C端构建了疫苗候选株，通过用等量的病毒颗粒（会生成不同HA表位拷贝数）和不同量的病毒颗粒（生成等量的HA拷贝数）对3种不同品系的小鼠进行免疫接种，结果发现不管是何种病毒量，也不管是何种品系的小鼠，表达在纤突上的HA表位都具有最好的体液免疫和细胞免疫效果[38]。该研究结果说明插入腺病毒衣壳蛋白的抗原表位引起的免疫反应强弱不一定取决于所在衣壳蛋白区域的拷贝数，体内实验才能最终说明实际的免疫效果。

3 结语

腺病毒自身作为疫苗和作为疫苗载体都有很高的科研和临床应用价值。但预存免疫的存在、病毒本身毒性降低的同时实现外源基因插入量的扩大，以及大规模细胞培养这3个因素都是限制其实际生产应用的主要问题。目前对腺病毒衣壳蛋白的修饰是腺病毒疫苗构建的主要策略，通过了解衣壳蛋白的基因嵌入靶点的特性，并结合外源抗原和表位的特点，通过合理的实验设计，相信腺病毒将会成为十分有前途的疫苗和抗原呈递载体。

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