冷诱导RNA结合蛋白研究进展

李俊峰，刘雨潇，张志文，洪鹏，薛菁晖

1.解放军总医院 第一附属医院神经外科，北京 100048；2.辽宁医学院解放军总医院第一附属医院 研究生培养基地，北京 100048

冷诱导RNA结合蛋白（cold inducible RNA binding protein，CIRP）是一种RNA结合蛋白，又称hnRNP A18。人CIRP的cDNA序列1997年由Fujita实验室率先克隆报道，GenBank/EMBL/DDBJ序列号为D78135[1]；同年，大鼠CIRP的cDNA由Xue等登录于 GenBank/EMBL/DDBJ，序 列 号 为 AB00362[2]。CIRP的相对分子质量为18 000，由172个氨基酸残基组成，包括2个明确的区域。第一个为RNA结合域（RMM基序），其中包括一个八聚体核糖核蛋白1（RNP1）和一个六聚体核糖核蛋白2（RNP2），此区域在不同的种系中高度保守，并且参与结合RNA；第二个为富甘氨酸结构（RGG基序），但它的功能还不清楚。

人类的CIRP基因定位在第19号染色体p13.3位点上[3]。第19号染色体是人类所有染色体中基因密度最高的，约有1500个基因，于2004年在Nature杂志上公布了全序列[4]。它具有高G+C含量、高复制率和高重排率的特点，预示着该染色体在生物进化中有重要意义。其中许多基因与呈孟德尔式遗传规律的疾病有关，包括家族性高胆固醇血症、非胰岛素依赖性糖尿病等。人体遭到辐射或其他环境污染，控制DNA修复的基因也在这条染色体上。在K562、HepG2、NC65等多种人类细胞系及大鼠的脑、肺、肾脏、肝脏、胃、结肠、卵巢、睾丸、甲状腺和骨髓组织中[2]，CIRP均有结构性的表达，并在应激原的刺激下表达升高或降低。

CIRP蛋白的细胞定位具有组织特异性。在人和动物的大多数细胞中，CIRP位于细胞核[1]，然而在人精子细胞质[5]和非洲爪蟾卵母细胞质[6]中也可检测到CIRP。有研究者发现CIRP可在应激原的刺激下，由精氨酸甲基化作用支配，从细胞核迁移至细胞质中，并据此推测CIRP在细胞中的位置取决于细胞的类型和状态[6]。

作为一种重要的生理活性物质，CIRP主要通过转录后水平的基因表达调控来发挥作用。转录后水平调控是细胞生长和分化过程中最重要的调节机制之一，会影响多种基因的蛋白表达水平和细胞内蛋白表达的特定位置，从而影响细胞的分化方向。RNA结合蛋白是转录后水平基因表达调控的主要承担者，调节mRNA的剪辑、出核、运输和细胞定位等[7]，并由此改变细胞的生理功能。目前对CIRP的研究主要在低温（32℃）下，其调控的关键点在于mRNA的翻译，通过CS-RBD来特异地与靶RNA的特异结构或序列结合来调控特定基因表达，从而对环境信号做出快速反应。另外，CIRP结合到mRNA的5′或3′非翻译区（UTR）可以影响翻译起始的速度和转录子的稳定性。但有一些问题还待进一步研究：一个RNA结合蛋白有多少个目标mRNA；RNA结合蛋白与mRNA的5′或3′UTR结合是否依赖其他蛋白，以及这些蛋白是如何影响其功能的；上述相互作用是如何增强或阻碍翻译的。

1 CIRP与应激反应

应激是指机体在受到应激原剌激时所出现的以交感神经兴奋和垂体-肾上腺皮质分泌增多为主的一系列神经内分泌反应，以及由此而引起的各种机能和代谢的改变。应激是一种全身性的适应性反应，在生理学和病理学中都有非常重要的意义，适当的应激对机体可以产生保护作用，过度应激则会造成伤害。应激是一个复杂的反应过程，通过研究它的发生原理、进程及其调控，使生物体能够在有效进行生理性应激的同时，最大限度地降低病理性应激及其带来的损害，无疑对人们日常生活及临床患者治疗都具有指导意义。此前多项研究表明，CIRP的表达水平受到众多环境因素的影响，在低温[8]、紫外线[9]、高渗[10]、缺氧[11]等应激状态下，CIRP 发挥着重要的细胞保护作用。

首先，CIRP的表达与低温高度相关，37℃条件下CIRP基因的转录产物不包含CIRP全长开放读框，温和冷处理可显著提高CIRP的表达水平，相反热处理会降低其表达水平。有研究者将K562、HepG2、NC65等细胞系由37℃转移至29℃，发现CIRP基因的表达水平在前12 h内显著升高，并据此推测CIRP在冷应激反应中发挥着重要作用。2006年，Sakurai等[8]发现低温条件下CIRP能够抑制肿瘤坏死因子TNF-γ和环已酞亚胺介导的细胞凋亡。2007年Kim等[12]研究表明，来源于拟南芥的CIRP蛋白能显著提高大肠杆菌对低温的适应能力。2011年本研究小组发现，低温条件下CIRP可抑制H2O2诱导的神经元细胞凋亡[13]。

除了低温外，缺氧也是影响CIRP表达水平的重要因素。氧浓度对于血管神经发育、糖代谢等生理活动有着重要的调节作用，当氧浓度降低时低氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）被活化，HIF-1可以通过上调血管内皮生长因子（vascu⁃lar endothelial growth factor，VEGF）和葡萄糖载体1（glucose transporter，Glut1）等蛋白的转录水平来促进血管生成，缓解低氧对生物体造成的损伤。最新的研究发现：①低氧信号转导通路与低温信号通路具有相同的组成元素。受低氧调控的mRNA与受低温调控的mRNA都包含内部核糖体进入位点（IRES），当环境发生改变时，大部分mRNA的翻译水平会受到影响，然而含有IRES元件的mRNA仍可有效翻译。②CIRP的mRNA序列中存在HIF-1α共有序列结合位点，低氧环境可通过HIF-1不依赖的机制诱导CIRP的表达[14]。

此外，大量的体外实验证明CIRP在紫外线照射及高渗透压条件下，发挥着细胞保护作用。当细胞受到紫外线照射损伤后，CIRP会由细胞核转位到细胞质中，并通过绑定特定的转录因子来活化应激诱导蛋白，使细胞迅速对环境信号做出应答[15]。具体过程如下：第一步，CIRP蛋白在应激信号的诱导下发生转位，聚集于细胞质的应激颗粒中，并发生甲基化。C端的甲基化水平决定了CIRP在细胞中的定位情况，而CIRP的定位情况似乎最终决定了应激状态下某种mRNA转录产物是发生降解还是发生易位。第二步，应激颗粒中的CIRP蛋白募集特异的mRNA，使它们移入应激颗粒。在紫外线照射下，靶向mRNA的3′UTR会直接与CIRP发生相互作用。最后一步，CIRP蛋白绑定复制蛋白A及硫氧还蛋白的3′UTR，通过与翻译元件的相互作用来从翻译水平调节特定mRNA的表达量。硫氧还蛋白是一种广泛存在的多功能蛋白，可通过抑制活性氧（reactive oxygen species，ROS）来调节细胞的细胞信号转导，可将H2O2还原为H2O，还可活化HIF-1与VEGF。

紫外线照射、低氧等应激因素除了通过甲基化修饰来调节CIRP的表达，还可通过活化GSK3β激酶使CIRP发生磷酸化，转位到细胞质中绑定硫氧还蛋白基因的转录产物。因此，深入研究体内促使CIRP发生磷酸化的激酶，从而阐明在不同应激条件下CIRP发挥作用的机制是下一步研究的热点。

2 CIRP与肿瘤发生

肿瘤发生的过程可以分为细胞永生化、细胞转化、细胞侵润、细胞转移几个阶段。细胞过度生长是肿瘤发生的重要因素，然而有机体具有精密的机制用以防止细胞不受控制的生长和恶变，细胞衰老就是其中之一。因此，当细胞因为基因突变而避免衰老时，肿瘤就会发生。1997年，Nishiyama等[1]发现CIRP在低温环境中可调节哺乳动物细胞的周期；2006年，Sakurai等[3]发现低温条件下CIRP具有抗凋亡作用；2009年，Artero等[16]发现低温等外界刺激引发的CIRP升高会增加P-ERK1/2的表达水平，并影响翻译起始蛋白4EB-P1与S6的磷酸化水平，从而使小鼠胚胎细胞发生永生化。上述研究提示，在温和低温条件下，内源性CIRP的活化可以极大限度地抑制细胞凋亡。此后的大量研究表明，生理条件下CIRP与肿瘤的发生具有密切联系。有研究分析了193例相同年龄段肿瘤患者的CIRP表达水平，发现CIRP表达升高与肿瘤发生具有相关性，33%结肠癌患者与45%乳腺癌患者的CIRP表达水平明显高于对照组。2009年Zeng等[17]发现抑制CIRP蛋白的活性会降低前列腺癌细胞（LNCaP，PC-3）的增殖能力，敲除CIRP基因不仅能降低癌细胞存活率，还能提高癌细胞对化疗药物的敏感性。此外有研究证实，HeLa、TERA2等细胞的生长也会因CIRP表达的降低而受到抑制。这提示CIRP也可被作为治疗癌症的靶点。

目前，对CIRP促进肿瘤发生的机制的看法是：翻译水平的突变在细胞转化及肿瘤发生中起重要作用，在常温条件下，CIRP可通过与翻译元件的相互作用来促进mRNA的翻译，加快特定蛋白的合成、刺激细胞增殖。其详细作用机制尚不明确。

3 CIRP在神经系统中的作用

1998年，Nishiyama等[18]发现CIRP位于小鼠神经元细胞核中，氨基酸序列类似于植物昼夜节律蛋白，可在小鼠神经系统的不同区域昼夜节律性表达，白天表达水平升高，夜间表达水平下降，并据此认为CIRP对神经发育具有重要的调节作用。2008年Stephanie等发现XCIRP在非洲蟾蜍的前脑发育中发挥着不可或缺的作用，敲除XCIRP会使蟾蜍前脑神经板异常增大。2010年，Saitoa等[19]将小鼠神经干细胞培养于含或不含表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）的培养基中，发现去除EGF会增加神经干细胞凋亡率、降低巢蛋白（nestin）阳性细胞数量，并促进神经干细胞分化为神经胶质细胞。然而适当的低温条件可通过活化CIRP来抑制去除EGF所引发的干细胞凋亡与分化，维持神经干细胞的干性。该研究提示CIRP在低温神经保护中发挥着重要作用，有望用于神经干细胞的冷冻保存。

本研究小组1997年从大鼠睾丸中克隆出CIRP基因，多年来一直致力于对CIRP基因的研究[2,20-21]。近年，我们主要探讨了CIRP在神经保护方面的作用，发现在常温环境下，CIRP在脑皮层和海马中低水平表达，在下丘区仅有微量表达；在低温环境下，脑组织中CIRP表达水平明显升高，且具有区域性和时间性差异，下丘脑区的CIRP表达增强的出现明显早于其他脑区。此外，缺血性损伤可以推迟低温造成的CIRP的表达，但并不能降低CIRP的表达量。在此基础上，我们进一步分析了CIRP在低温条件下对神经元细胞凋亡的调节作用，发现低温环境能通过活化CIRP来抑制H2O2诱导的神经元细胞凋亡。上述研究结果提示，CIRP在低温神经保护中可能发挥重要作用。

4 CIRP调节生物节律相关基因的表达

2012年，有关CIRP的生物学功能研究有了突破性进展。日内瓦大学的Schibler教授揭示了体温节律性变动影响“昼夜节律基因”表达的分子机制[22]。他们发现温度的变化可调节CIRP蛋白的节律性表达，是体内昼夜节律基因激活的必要条件。我们身体中的大部分细胞内有一个“昼夜节律调解系统”,由一组基因组成，周期性变化。研究人员还发现，与大部分调控蛋白不同，CIRP是通过结合到某些基因转录物的RNA上来控制这些基因的表达并发挥调节作用的。机体的许多生理功能如心率、激素分泌、体温等都与细胞内部昼夜节律基因表达的时相及强弱相关，CIRP与这些调控的关系正一一解明。同一团队利用开发的尖端遗传工程技术鉴别了活细胞中几乎所有与CIRP结合的靶RNA，得出“在细胞中CIRP结合了编码不同昼夜节律调节器蛋白的转录物，提高了它们的稳定性，使得它们累积”的结论，说明这种调节顺序是，温度变化诱导CIRP表达发生变化，再激活下游昼夜节律调节器基因，引发机体发生生物学功能改变。这一发现，使我们观察到的每1℃体温差异都呈现出新的意义。受到CIRP调控的这些生化体系中，还发现了一个参与药物解毒和代谢的蛋白DBP（albumin D-site-binding protein），它的周期性累积可对药物代谢起调节作用。有些抗癌药物在早上给予患病的小鼠可导致100%的死亡率，而在晚上接受同样剂量的小鼠却全部存活了下来。这表明体内生物钟对药物的效用和毒性有着极其重要的影响。

5 CIRP的其他作用

CIRP除了调控与昼夜节律相关基因的表达强度外，可能也参与其他细胞过程，如细胞周期进程及细胞黏着相关功能。实验证实，肝细胞再生依赖这一调节过程[23]。还有研究表明，CIRP在胚胎发育、动物冬眠等活动中也起重要作用。Saito等[24]发现牛蛙脑中CIRP的表达量受到季节的影响，夏季表达降低，冬季则显著升高，并据此推测CIRP表达变化与动物冬眠相关，可能在冬眠过程中发挥一定的作用。2008年Kenkichi等[25]以日本树蛙为模型再次证实CIRP的表达量与动物冬眠之间存在着一定的关系。尽管观察到了上述现象，CIRP在动物冬眠中所发挥的具体作用还有待进一步研究。在原肠（胚）形成过程中CIRP高表达，有研究者降低了非洲爪蟾胚胎中CIRP的表达量，发现超过半数的胚胎在22细胞期时死亡，此外该研究者还发现在胚胎发育至32细胞期时降低CIRP的表达量会导致胎肾发育异常。

6 结语

综上所述，CIRP作为一种冷应激状态下大量表达的RNA结合蛋白，广泛参与细胞的各种生理过程，并在其中发挥重要作用。有关CIRP的研究将有助于揭示应激反应的分子机制，其在神经元缺氧状态下抗凋亡作用的发现，也为神经保护药物开发提供了新的实验依据。鉴于其表达改变会对细胞生长周期带来影响的特点，我们也思考其抑制肿瘤细胞生长的可能性。有关CIRP的研究已取得了可喜进展，今后还有很多领域吸引我们的关注，如与CIRP发生结合的众多mRNA，其编码的蛋白质在体内具有何种功能，是如何被调节的；CIRP与靶mRNA的结合是否依赖上游蛋白的调节；CIRP在神经元保护功能中的作用机制等。温和的低温条件是诱导哺乳动物细胞产生重组蛋白的有效工具。在32～33℃条件下，CHO细胞产生重组蛋白的效率远高于37℃。已知低温保护可用于包括心脏外科、神经外科、器官移植中的器官转运等多个领域，低温对心脏停搏或中枢神经系统缺血的治疗及预后具有重要意义。还有文献报道，哺乳动物对温和低温产生的应激反应与长时间航天旅行相似。我们认为，由温度改变引发的CIRP表达量的改变，进而造成下游一系列的生物学改变，其对生命过程的意义值得深入研究。

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