结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖的提纯及活性初步鉴定

戴振华，郭兰芹，冯晓燕，张立，郄霜,4，杨锡琴，修冰水，陈堃，彭瑞云，张贺秋

1.军事医学科学院 a.基础医学研究所；b.放射与辐射医学研究所；北京 100850；

2.华北石油总医院，河北 任丘 062552；3.天津海河医院，天津 300350；4.河北联合大学，河北 唐山 063000

结核病（tuberculosis，TB）是一种古老的疾病，自上世纪90年代，本已得到控制的肺结核又在世界范围内广泛流行，每年超过200万人死于TB[1]。2009年,世界卫生组织发布报告，2008年中国TB发病人数为100万～160万，仅次于印度，居世界第2位。这表明TB的预防和控制在我国尤为重要。

脂阿拉伯甘露聚糖（lipoarabinomannan，LAM）是分枝杆菌细胞壁的重要组成部分，包含9个单克隆抗体结合表位，属结核分枝杆菌特异性抗原，具有较强的免疫原性和免疫调节功能，可刺激机体产生相应的抗体[2]，因而是结核病血清学诊断中应用较广的抗原。

我们参照有关文献[3]，初步建立了从结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）中提取和纯化LAM的方法，并采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测结核患者血清中的抗LAM抗体，取得了较为满意的结果。

1 材料与方法

1.1 血清标本

64例肺结核病患者来自天津海河医院，全部为连续纳入的临床新近诊断的活动性肺结核患者，未合并感染HIV，未接受抗结核治疗或治疗时间不超过2周。67份健康对照血清样本来自健康献血员，无临床症状，未感染其他疾病。

1.2 材料

MTB标准菌株H37RV由本室保存；改良罗氏培养基购自贝索公司；羊抗兔IgG-HRP购自中杉金桥公司；兔抗LAM购自Mossman Associates Inc公司；L-阿拉伯糖购自Sigma公司；硝酸纤维素膜为Pall公司产品；甲醇、氯仿、苯酚、95%乙醇、硫酸均为国产分析纯产品；离心机为Sigma公司产品；细胞粉碎机为宁波新芝超声设备有限公司产品；紫外分光光度计为UNICO公司产品；凝胶成像仪为Bio-Rad公司产品。

1.3 LAM抗原的提纯

将MTB H37RV接种在罗氏鸡蛋培养基上，37℃培养3～4周，收取菌落，100℃灭活2 h，用蒸馏水和PBS（pH7.4）各洗涤1次，再用氯仿∶甲醇（2∶1）混合液脱脂3次，去除菌体中的培养基成分，用PBS（pH7.4）悬浮，冰浴超声破碎（超声30 s，停30 s，共10 min），8000 r/min离心取上清，加入40%的苯酚萃取（70℃ 1 h），4℃、8000 r/min离心取上清，用蒸馏水透析2 d，用2倍体积的95%乙醇沉淀，LAM存在于上清液中，分装，冻干。

1.4 LAM的鉴定

将提纯的LAM进行SDS-PAGE，分别用考马斯亮蓝染色和Western印迹鉴定；将LAM转印至硝酸纤维素膜，用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭1 h；以兔抗LAM为一抗，4℃孵育过夜；用TBST洗膜3次，每次5 min；用羊抗兔IgG-HRP室温孵育1 h；用TBST洗膜3次，每次5 min；用TBS洗膜1次，5 min；加化学发光液，于成像仪中照像。

1.5 LAM的含量测定

采用苯酚-硫酸法检测糖含量。以双蒸水为空白对照，以L-阿拉伯糖为糖标准，分别配制1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 mg/mL 的标准糖溶液；取双蒸水200 mL、样品200 mL、糖标准液200 mL，各加入浓硫酸1 mL、9%苯酚200 μL，摇匀后置暗处30 min；测定D485nm值，空白调零后，以糖浓度为横坐标、D485nm值为纵坐标，制作浓度范围0.1～1 mg/mL的标准曲线，直线回归计算样品中的糖含量。

1.6 ELISA法检测血清中的抗LAM抗体

用纯化的LAM包被酶联测定板，包被液（0.05 mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6）稀释，每孔0.125 mg抗原包被96孔酶联板，4℃过夜，洗板2次，每次1 min；用1%牛血清白蛋白（BSA）磷酸盐缓冲液（pH7.4）室温封闭4 h，拍干；新鲜血清样本用稀释液按1∶10稀释后加入96孔酶联板，37℃孵育30 min，洗板5次，每次1 min；分别加入抗人IgG酶结合物，37℃孵育20 min，洗板5次，每次1 min；将显色液A和B按照1∶1的比例混合后加入各孔，37℃孵育10 min，加入终止液终止显色，在酶标仪上检测样本的D450nm值。

1.7 统计学方法

应用GraphPad Prism 4对数据进行统计学分析。数据符合正态分布，采用t检验，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LAM鉴定结果

样品经SDS-PAGE，凝胶用考马斯亮蓝染色，未见明显条带，说明提纯得到的样品基本不含蛋白质；经Western印迹分析（图1），LAM迁移范围相对分子质量为25×103～40×103，主要集中在35×103处。

2.2 LAM含量测定结果

1.13 g湿重菌体经超声离心后去除沉淀0.86 g，得到粗制细胞壁0.27 g，提纯得到LAM共4 mL，经苯酚-硫酸法测定，样品中的糖含量为3 mg/mL。最终提取得到12 mg LAM，LAM总收率约10.6 mg/g湿菌体。

2.3 血清标本ELISA检测结果

以纯化的LAM为抗原，通过ELISA方法检测64例结核病患者、67例健康体检者的血清，结果见表1。LAM抗体在结核组明显高于健康对照组，差异具有统计学意义（t=8.668，P＜0.001）。以D450nm值≥健康体检组的 D450nm均值+2s（cut-off值=0.2045）为阳性，检测的敏感性为67.19%（43/64，95%CI：54.31%～78.41%），特异性为95.52%（64/67，95%CI：87.47%～99.07%）（图2）。图3为抗LAM抗体检测的ROC曲线（曲线下面积=0.9228，面积越接近1说明检测的性能越好）。

3 讨论

细菌细胞表面的成分通常被视为寻找新的疫苗和诊断的重要靶标。LAM是构成结核分枝杆菌细胞壁的重要糖脂，占细菌总重量可能高达15 mg/g，其特征最早在1980年确定[4]。LAM由甘露聚糖主链组成，连接含有糖精侧链的寡阿拉伯糖，前者连接到磷脂酰肌醇的脂质锚定基团[5]。已报道LAM在感染的宿主中对免疫系统影响广泛，从结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌中分离得到的LAM可引起T细胞增殖的抑制[6]，干扰γ-干扰素介导的巨噬细胞的活化，清除毒性氧自由基，抑制蛋白激酶活性[7]，合成mRNA编码的白细胞介素-2、-5，及刺激人T-细胞中的粒细胞/巨噬细胞形成集落刺激因子[8]，促进单核细胞产生肿瘤坏死因子[9]，活化和调解补体[10]。这些发现表明，LAM很可能在结核病及其他分枝杆菌感染疾病的发病机理中起很大作用。

表1 抗LAM抗体血清检测结果（n）

图1 LAM的Western印迹1：预染marker；2：提纯的LAM

图2 抗LAM抗体血清检测结果的散点图

图3 抗LAM抗体血清检测形成的ROC曲线

在细胞表面，LAM作为一种免疫调节剂可以很容易地与宿主受体进行相互作用[11]。LAM具有高免疫原性，在分枝杆菌感染过程中产生抗LAM抗体[2]，在血清中很容易检测到抗LAM抗体[12]，检测抗LAM抗体已用于诊断活动性肺结核[12-13]。在循环抗原-抗体免疫复合物中会发现LAM抗原和抗LAM抗体聚集[13]。国内在此方面的研究较少，而且没有相关试剂盒，而进口试剂相对较贵，限制了我国以LAM为靶标的针对结核病的检测。我们旨在寻找一种简单的LAM纯化方法，将纯化得到的LAM用于结核病的血清学检测，使LAM抗体检测试剂能国产化，并为今后以LAM为基础的研究提供材料来源，制备相应抗体，对诊断和检测MTB的感染，筛选抗结核药物及预测抗结核治疗的预后具有一定的价值。

关于LAM的纯化，有离子交换、凝胶过滤色谱法的组合[4]，疏水性相互作用色谱法[14]及Sephacryl S-100凝胶柱层析法[15]，但都比较繁琐。我们在Wu[3]方法的基础上略做改动，添加了脱脂去除培养基成分，再通过苯酚萃取、乙醇沉淀，得到LAM，取得较理想的浓度和纯度。此法总的处理时间只需要3 d，操作简单，得率高。LAM是由多种成分组成的异质体，不同异质体由不同的糖基化和酸基化程度决定，用此法得到的LAM能覆盖不同大小的LAM。

利用纯化得到的LAM，通过ELISA方法初步检测64例结核病患者、67例健康体检者血清，检测敏感性为67.19%，特异性为95.52%。Sada[16]等研究表明，在痰涂片培养阳性的活动性肺结核患者中检测的敏感性为88%，在痰抗酸染色阴性的活动性肺结核患者中检测的敏感性为67%，在合并HIV感染的肺结核患者中检测的敏感性为57%，特异性均为100%。敏感性和特异性的差异可能与抗原浓度、包被浓度、血清稀释度、酶标抗体的效价，以及显色系统都有一定的关系；本次检测的样品数量较少、样品未分组也是差异形成的原因，仍需要扩大样本量来进一步确定此LAM的应用价值。

抗原检测可以克服抗体检测不能鉴别是MTB的急性感染还是以往对MTB的暴露，能解决TB早期诊断的缺陷。大量研究表明[17-18]，在结核病患者体液，如痰、血液、胸腔积液和脑脊液，特别是尿液中，都能检测到LAM抗原，检测的敏感性为20%～91%，特异性为83.3%～100%。国内尚无检测LAM抗原的商业化试剂盒，因此还需要我们进一步加强对LAM抗体制备和LAM抗原检测的研究探索。

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