MS2噬菌体衣壳蛋白与包装位点结合特异性及其生物学应用进展

孙士鹏，刘贵建

中国中医科学院 广安门医院检验科，北京 100053

噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，因部分能引起宿主菌的裂解，故称为噬菌体。MS2噬菌体为正义单链RNA噬菌体，属于轻小噬菌体科、轻小噬菌体目、轻小噬菌体属,由外裹蛋白衣壳的核酸组成，是性菌毛RNA大肠杆菌噬菌体的4个血清型中第1血清群的典型代表。MS2噬菌体基因组含有3569个核苷酸，同时作为mRNA编码4种蛋白质分子，即成熟酶蛋白（也称A蛋白）、衣壳蛋白、复制酶蛋白和裂解蛋白[1-2]。MS2噬菌体能够通过吸附性菌毛（F-pili）感染雄性大肠杆菌，感染后每个细胞能产生103～104个噬菌体[2]。电子显微镜下MS2噬菌体直径约27 nm[3]，衣壳蛋白是噬菌体外壳的主要蛋白，由180个化学结构一致的亚基组成，每个亚基含有129个氨基酸残基，形成二十面体对称结构[4]。A蛋白的功能是使噬菌体识别宿主并使其RNA基因组进入宿主菌，每个噬菌体一般只存在1分子的A蛋白。噬菌体对宿主寄生具有高度特异性，只能侵染一种细菌中的某一菌株。MS2噬菌体的宿主是大肠杆菌，在人和动物的排泄物或污染的井水、河水中广泛存在，因其物理结构、组成和形态学、环境生存力与人肠道病毒极其相似，且易于培养，可作为人肠道病毒的替代病毒，用于水和污水的研究等[5-8]。

1 MS2噬菌体衣壳蛋白与包装位点结合特异性的生物学应用

MS2噬菌体复制酶编码基因5'端存在一个由19个碱基组成的茎环结构（包装位点，ACAUGAGGA UUACCCAUGU），是衣壳蛋白二聚体与RNA相互作用的部位，这种相互作用形成的复合物是噬菌体自我包装的信号，在复合物的基础上，成熟酶蛋白与其他包膜蛋白分子结合，并在自由能的驱动下形成相应的空间构像，完成MS2噬菌体的组装[2]。包装位点同时还是一个翻译调节元件，当衣壳蛋白表达量超过组装需求量后，衣壳蛋白二聚体与包装位点的结合能阻止核糖体结合到复制酶的起始位点上，从而抑制复制酶的翻译，完成其对翻译的调节[9-10]。

1.1 用于RNA病毒核酸检测的标准物质、校准品和质控品

利用衣壳蛋白二聚体与包装位点结合的特异性，通过基因克隆技术，把包装位点编码RNA融合至外源RNA序列上，即可将外源RNA包装到衣壳蛋白内组装成MS2噬菌体样颗粒（或称病毒样颗粒，VLP）。Peabody[11]等构建了一个双质粒表达系统，其中一个表达质粒用来表达MS2衣壳蛋白，另一个表达质粒中克隆了MS2 RNA包装位点的cDNA序列和lacZ基因，lacZ基因在包装位点的cDNA序列的下游。由于这2个表达质粒含不同的复制起点和抗生素抗性基因，因此可共存于同一个宿主菌中。然后，把这2个重组表达质粒同时转化大肠杆菌，经过夜培养和诱导表达后，形成了大量包装外源RNA的MS2 VLP。在此基础上，其他研究人员发展了带盔甲的RNA（armored RNA）技术，顾名思义，MS2衣壳蛋白像盔甲一样能够有效保护RNA不被RNA酶降解，具有耐RNA酶、类似病毒颗粒和无生物传染危险性的特性，被广泛用于RNA病毒核酸检测的标准物质、校准品和质控品[12-15]。Rowsell等将MS2野生型19碱基茎环结构的-5位尿嘧啶替换为胞嘧啶（命名为C-variant），使C-variant适配体与衣壳蛋白的亲和力与野生型相比提高了10～50倍[16]。卫生部临床检验中心的李金明研究员等通过对C-variant的数量和位置改变，使得MS2 VLP能够包装2000 nt以上的外源RNA。研究者采用双质粒共表达系统在大肠杆菌内表达了含6个基因片段［SARS-CoV1、SARS-CoV2、SARS-CoV3、禽流感基质蛋白基因（M300）和H5N1型禽流感（HA300）基因片段］共2248 nt的VLP[17]。采用单质粒双表达系统在大肠杆菌内能够将长度达到3024 nt的外源病毒RNA成功包装到MS2 VLP内[14]，此长度的外源RNA已很接近野生型MS2基因组RNA（3569 nt）。虽然目前不能确定3569 nt是否是MS2 VLP包装外源RNA的长度极限，但笔者研究发现，随着包装外源RNA长度的增加，相应的包装效率会下降。

1.2 用于实时动态监测活细胞内RNA的运动

衣壳蛋白和包装位点特异性结合的特性还被广泛用于实时动态监测活细胞内RNA的运动，如小鼠白血病病毒的RNA转运和HIV-1 RNA动态转录、包装过程等[18-23]。RNA实时动态监测系统是使用基因克隆技术，将MS2噬菌体衣壳蛋白与绿色荧光蛋白（GFP）融合表达，被监测的RNA分子上融合有多个串联重复的MS2噬菌体衣壳蛋白的结合位点（包装位点序列），当MS2-GFP融合蛋白与靶RNA共表达时，大量带有GFP标签的衣壳蛋白会与每个RNA分子上的包装位点序列结合，在显微镜下形成明亮的荧光颗粒，进而能够指示RNA的运动。

1.3 用于细胞内mRNA相关microRNA的鉴定

microRNA（miRNA）是一类长约19～24 nt的非编码单链小RNA分子，人类miRNA在RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ的作用下转录成初级miRNA（pri-miRNA），在细胞核内被切割成约70 nt的miRNA前体（premiRNA），随后pre-miRNA通过RanGTP/Exportin 5的转运机制被运送至细胞质，进一步被切割加工为成熟的miRNA。在动物中，miRNA可通过与靶基因3′UTR区互补结合，抑制靶基因翻译成蛋白质，进而在细胞、组织或个体水平上影响生物体的生长发育，并参与免疫反应[24]和多种疾病过程[25-26]。长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一群长度为200～100 000 nt的RNA分子，具有mRNA样结构，起初被认为是基因组转录的“噪音”，是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物，不具有生物学功能。然而，近年发现lncRNA参与X染色体沉默、基因组印记及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程[27-30]。目前对lncRNA功能的研究才刚刚开始。Yoon等利用MS2衣壳蛋白和包装位点结合的特异性，以lincRNA-p21为例，创造了一种被称为MS2-TRAP（MS2-标签RNA亲和纯化）的鉴定细胞内与RNA结合的miRNA方法[31]，鉴定了多种与lincRNA-p21结合的miRNA。他们构建了几种质粒，包括表达含24个包装位点的pMS2质粒、融合表达谷胱甘肽S-转移酶（GST）和MS2 RNA结合蛋白及核定位信号（NLS）的pMS2-GST质粒、表达含24个包装位点作为标签的目的RNA的质粒pMS2-lin⁃cRNA-p21。pMS2和pMS2-GST共转染小鼠胚胎成纤维细胞作为阴性对照，pMS2-lincRNA-p21和pMS2-GST共转染小鼠胚胎成纤维细胞作为实验组。转染后，在细胞内形成RNP复合物MS2 RNA/MS2-GST和lincRNA-p21-MS2 RNA/MS2-GST。裂解细胞后用含有还原型谷胱甘肽的琼脂糖珠子纯化2种复合物，提取其中的RNA，用反转录实时荧光定量PCR扩增鉴定相关miRNA。

1.4 用于RNA递送载体的研究

RNA可分为编码RNA和非编码RNA。编码RNA即mRNA，是能够编码蛋白质的RNA；非编码RNA是不编码蛋白质的RNA，包括rRNA、tRNA、sn⁃RNA、snoRNA、lncRNA和miRNA等。MS2噬菌体为正义单链RNA噬菌体，因其衣壳蛋白二聚体能够识别并包装含有包装位点的外源性RNA，进而形成MS2 VLP，因而可用于包装编码RNA，如抗原编码mRNA、调节因子编码mRNA、具特定生物活性蛋白编码mRNA，还能包装非编码RNA，如反义RNA和miRNA等，可作为RNA疫苗和RNA递送载体[32-34]。

MS2是正义单链RNA噬菌体，宿主细胞是大肠杆菌。天然MS2的基因组RNA为原核RNA。Leg⁃endre等在酿酒酵母细胞YPH499内表达了带有MS2包装位点的外源mRNA的MS2 VLP，并证实这些mRNA可在哺乳动物细胞内行使功能[10]。笔者利用单质粒表达系统，在酿酒酵母YPH499细胞内用MS2衣壳蛋白包装了HIV-1 gag mRNA，形成了MS2 VLP，此VLP具有很好的耐DNase和RNase的特性[33]。提取RNA转染哺乳动物细胞（293T细胞、CHO细胞）后可检测到目的蛋白的表达。我们还进一步证实了纯化的pMS-GAG VLP免疫BALB/c（H-2d）小鼠后可以诱导抗原特异性体液免疫应答[33]。以上研究说明，不仅原核表达的MS2 VLP能包装外源性原核RNA，通过真核表达系统获得的MS2 VLP还可用于真核mRNA的递送。

反义RNA是与特异靶RNA（主要是mRNA）互补的RNA分子，可通过配对碱基间氢键作用与靶RNA的特定互补区域结合形成双链复合物，抑制靶RNA的功能，从而调控基因的正常表达[35-36]。反义RNA不编码蛋白质，因而其结构与真核mRNA不同，仅需要其序列与靶RNA序列互补即可，因此无论原核还是真核表达系统获得的包装有MS2噬菌体样颗粒均可用于抑制相应靶mRNA的表达。魏葆珺等采用双质粒表达系统，其中用pET28（b）载体表达MS2成熟酶蛋白和衣壳蛋白，通过RT-PCR获得人HCV 1～389 bp cDNA序列，反向插入pACYCDuet-1表达载体，转录后可产生针对HCV 5'UTR和IRES区的反义RNA。2种重组质粒共同转入感受态大肠杆菌BL21（DE3）后用IPTG诱导表达，形成了内含反义RNA的MS2 VLP。源于HIV-1的Tat转导肽具有多种靶细胞，可直接与细胞膜相互作用将外源性分子转入细胞内。Tat转导肽发挥转运作用的最短有效序列为47YGRKKRRQRRR57。将内含反义RNA的MS2 VLP与HIV-1 Tat47-57转导肽通过化学交联剂Sulfo-SMPB交联，在Tat47-57转导肽的作用下将VLP转入含HCV-萤火虫萤光素酶报告基因的Huh-7细胞发挥功能，展示出其用于病毒感染治疗的潜力[32]。

新近研究发现，通过原核表达系统获得的装载有功能性pre-miR-146a序列的MS2噬菌体样颗粒与Tat转导肽交联后可将其作为miRNA的新型递送载体，能够被HeLa、HepG2、Huh-7及外周血单核细胞摄取，pre-miR-146a能在细胞内被加工为成熟的miR-146a，使细胞内miR-146a浓度增加5倍以上，进而有效抑制下游靶基因的表达[34]。小鼠尾静脉注射100 μg与Tat交联的MS2 VLP后，可在小鼠外周血淋巴细胞、脾、肺、肾中检测到高表达的miR-146a，致使自身抗体和总IgG水平下调[37]。以上研究证实了MS2 VLP还能够作为miRNA体内递送载体，有效地将miRNA递送至靶细胞并发挥功能。

2 结语

综上所述，MS2噬菌体衣壳蛋白与包装位点结合特异性强，MS2噬菌体样颗粒能够有效保护包装RNA不被RNA酶降解，被广泛应用于RNA病毒核酸检测的标准物质、校准品和质控品的研究。二者间结合的特异型可作为细胞分子生物学研究的工具，如对活细胞内功能性RNA实时动态监测和细胞内转录RNA相关miRNA的鉴定。通过真核细胞表达系统化获得包装外源功能性蛋白质编码mRNA，如抗原编码mRNA、调节因子编码mRNA、具特定生物活性蛋白编码mRNA，在疫苗和基因转运等研究方面亦具有重要的应用价值。此外，如通过分子克隆技术对MS2衣壳蛋白进行改造，将诸如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列（整合素αⅤβ3特异识别的配体结构）的肿瘤细胞靶向序列展示在MS2 VLP衣壳表面，获得包装有抑癌miRNA和/或抑癌lin⁃cRNA的MS2 VLP，不仅会实现肿瘤细胞的靶向性，还能通过多个靶点抑制肿瘤细胞生长或杀死肿瘤细胞，有可能给肿瘤的基因治疗带来新的突破，并为miRNA药物治疗相关载体的构建、病毒感染、遗传病等的治疗研究带来新的思路。

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