葡萄酒酿造过程中微生物多样性的研究现状

孙炜宁，张巧格，李兴兴，韩烨

（天津大学化工学院，天津300072）

葡萄酒酿造过程中微生物多样性的研究现状

孙炜宁，张巧格，李兴兴，韩烨*

（天津大学化工学院，天津300072）

葡萄酒是由新鲜葡萄浆果或葡萄汁发酵而成的酒精饮料。葡萄酒的酿造过程本质上是包括酵母、细菌、丝状真菌在内的多种微生物复杂作用的过程。本文主要阐述了从葡萄收集直到葡萄酒后发酵过程中，微生物的种类及数量的变化情况及葡萄酒酿造中微生物之间的相互作用对微生物多样性的影响。

葡萄酒；微生物多样性；微生物相互作用

葡萄酒酿制过程的本质是从葡萄收集、葡萄破碎成汁、葡萄酒一次、二次发酵直到包装、储藏整个酿造过程中多种微生物的代谢过程。葡萄汁发酵物及葡萄酒中的环境是低pH及高酒精浓度的，只有耐酸耐酒精的微生物可以生长。在酿酒过程中最重要的菌株为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae及酒酒球菌Oeno－coccus oeni分别进行酒精发酵及苹果酸—乳酸发酵（malolactic fermentation，MLF），其他菌株在葡萄及葡萄酒中生长的微生物对酒的品质有显著的影响。

1 葡萄酒的简要酿制过程

葡萄酒的酿造始于收集和破碎葡萄。白葡萄酒通过冷沉淀、澄清过滤或离心分离葡萄汁与葡萄皮，然后将葡萄汁移至木桶中。酒精发酵是由果汁中的自带酵母或通过接种酿酒酵母发酵完成。将葡萄汁中主要的葡萄糖及果糖消耗后，酒被认为是“干葡萄酒”，将酒液与酵母及葡萄的残渣分离。

红葡萄酒的生产与白葡萄酒的生产略有不同。葡萄经破碎后葡萄皮浸泡在发酵液中提取颜色。红葡萄酒通过自带酵母或接种发酵剂进行酒精发酵。在葡萄发酵中葡萄皮会漂浮到顶部形成一个“帽子”。为了更好地提取红颜色和丰富葡萄酒风味，酿酒师采取穿孔或从底部泵汁的办法去除“帽子”的影响。一段时间后，葡萄酒与葡萄皮分离，葡萄汁在另一个容器中进行发酵直至完成。酒精发酵完成后，根据葡萄酒的情况通过自带或接种乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）自发或有目的进行MLF，将苹果酸转化为乳酸。待发酵结束后要对葡萄酒中残留的微生物进行处理，防止酒的腐败[1]。

2 不同酿酒时期微生物的多样性

2.1 葡萄园中与酿酒相关的微生物

葡萄中一半的酵母来自葡萄园如尖顶型的无性生殖的酵母，汉森氏酵母属Hanseniaspora和克勒克酵母属Kloeckera。葡萄园中还存在一些对酿酒有作用的酵母掷孢酵母属Sporobolomyces、克鲁维酵母属Kluyveromyces[2]。

2.2 葡萄表面及浆果中的微生物

葡萄中的微生物的类型会影响随后发酵过程中的生态环境尤其是在发酵初期的环境。浆果中微生物的数量水平大致在107CFU/g～108CFU/g，其中酵母的数量在105CFU/g～106CFU/g。浆果中的酵母种类有梅奇酵母属Metschnikowia、假丝酵母属Candida、隐球酵母属Cryptococcus、红酵母属Rhodotorula、毕赤氏酵母属Pichia、接合酵母属Zygosaccharomyces、球拟酵母属Torulopsis，占主导地位的是梅奇酵母属及汉森酵母属。破损的葡萄中汉森酵母属Hanseniaspora、假丝酵母属Candida、梅奇酵母属Metschnikowia数量显著增加。酿酒酵母saccharomyces cerevisiae在葡萄中很少见，数量少于10CFU/g～100CFU/g[3-6].

同时发现有醋酸菌（葡糖杆菌属、醋酸杆菌属）、LAB在葡萄微生物群中占据一小部分。

丝状真菌聚集在葡萄的表面，可以侵染葡萄（葡萄孢属Botrytis、链格孢属Alternaria、单轴霉属Plasmopara、曲霉属Aspergillus）；其中较常见的有短梗茁霉AureobasidiuMpullulans及灰霉菌Botrytis cinerea。生长在葡萄上的霉菌产生多种代谢物如真菌毒素赭曲霉素A并且干扰葡萄的微生物生态环境并从而影响酒精发酵中酵母的生长，改变酒的风味。葡萄孢属会影响糖类、酒石酸、苹果酸的代谢，减少总糖量，提高葡萄酒的pH。灰霉菌可造成灰霉病，其它的霉菌可以参与由其它微生物引发的感染，但自己不足以引起感染[7-8]。此外，真菌在葡萄表面会创造一种利于醋酸菌生长的环境，醋酸菌数量的增多易造成酒的腐败。

2.3 葡萄汁及葡萄酒中的微生物

2.3.1 葡萄汁及葡萄酒中的细菌

新鲜无破损的葡萄制成的葡萄汁中只有少量的细菌（＜103CFU/mL～104CFU/mL），当酵母启动酒精发酵后，细菌生长停滞并逐渐死亡。根据葡萄汁及葡萄酒的酸度、营养物质、氧气、酒精浓度，其中生长活跃的细菌通常包括LAB及醋酸菌。其他的细菌如梭状芽胞杆菌clostridia、放线菌actinomyces、链霉菌属streptomyces也存在于酒的环境中，但比较少见。被土壤污染的葡萄中存在梭状芽胞杆菌，它产生的孢子对热和化学处理有很强的抵抗力，因此处理被它污染的酒液比较棘手。链霉菌属可降解纤维造成对过滤装置的破坏。大多数与酒相关的细菌及很多酵母对SO2敏感[9]。

LAB是兼性厌氧菌，在厌氧的环境中可存活；参与酿酒的LAB主要来自4个属（乳杆菌属Lactobacillus、片球菌属Pediococcus、明串珠菌属Leuconostoc、酒球菌属Oenococcus[10]）。这些微生物普遍存在于葡萄及酿酒环境中。葡萄的破碎成数量级的增加了乳酸菌的数量；酒精发酵的第一周酿酒酵母产生的酒精减少LAB的数量，通常低于103CFU每mL；酒的pH强烈的影响LAB的存活，在发酵中及发酵后pH高于3.5对乳杆菌属及片球菌属的存活有利，当pH低于3.5对酒球菌属存活有利[11]。新发酵的葡萄酒中LAB的数量较低，主要是由于pH、酒精、抑菌物质如SO2等因素的影响。当酒进入贮藏阶段，LAB对酒精的耐受力增加。LAB的数量又有所增长[12]。

在一些葡萄酒中会发生MLF，它是一种重要的二次发酵，在酒精完全发酵后的两到三周内进行[13]。酒球菌O.oeni主导MLF通过将L-苹果酸转化为L-乳酸从而降低酒的酸度、产生其他代谢物增进酒的风味、消耗多余的养分提高酒中微生物的稳定性，对葡萄酒的酿造具有重要的影响[14]。

醋酸菌是革兰氏阴性需氧菌，可利用甘油和酒精产生醋酸、乙醛、乙酸乙酯。葡萄酒中的醋酸菌主要来自3个属，醋杆菌属Acetobacter、葡糖杆菌属Gluconobacter、葡糖醋杆菌属Gluconacetobacter[15]。破碎的葡萄中含有相当数量的葡糖杆菌属，其产生的葡萄糖酸及其它含羰基化合物可以与SO2结合，降低亚硫酸盐的抑制作用，导致葡萄汁的腐败。一旦进行葡萄汁发酵，厌氧环境有效抑制醋酸菌的生长和新陈代谢。但有很多醋酸菌在厌氧发酵结束后仍存在，并未完全消除在发酵过程中[16]。事实上，醋酸菌在木桶顶部存在空气的环境中可存活，直到活跃发酵期木桶顶部被CO2充满。发酵过程中泵送酒液到顶部有效减轻醋酸菌对葡萄酒的毒害作用。

2.3.2 葡萄汁及普通酒中的酵母

葡萄汁及葡萄酒微生物中酵母占据主导地位。葡萄汁及葡萄酒中还包含大量的酵母如梅奇酵母属Metschnikowia、酒香酵母属Brettanomyces、毕赤氏酵母属Pichia、假丝酵母属Candida、汉森氏酵母属Hanseniaspora、克鲁维酵母属Kluyveromyces、孢圆酵母属Torulaspora、德巴利氏酵母属Debaryomyces、接合酵母属Zygosaccharomyce、裂殖酵母属Schizosaccharomyces[17]。其中的汉森氏酵母、假丝酵母、梅奇酵母启动酒精的发酵。毕赤氏酵母属、伊萨酵母属Issatchenkia、克鲁维酵母属在这一阶段进一步增长。这些酵母的浓度会达到106CFU/mL～107CFU/mL。这些酵母在发酵中期逐渐减少[18-19]。酿酒酵母对其代谢产物尤其是酒精的高耐受力使它成为发酵中期及后期的优势菌种，浓度达到107CFU/mL～108CFU/mL。汉森氏酵母属、假丝酵母属、梅奇酵母属、伊萨酵母属、克鲁维酵母属对浓度超过5%～7%的酒精没有耐受力，在发酵中期逐渐减少。这些菌株在低温时对酒精的敏感度降低，当温度低于15℃～20℃，假丝酵母及汉森氏酵母发酵一部分酒精。与酿酒酵母一样在发酵后期成为优势菌株[20]。

2.4 葡萄汁及葡萄酒中微生物多样性的影响因素

2.4.1 环境因素

很多环境因素影响葡萄酒中的微生物菌群。其中pH的影响最大，低pH（＜3.5）抑制很多细菌，尤其是乳酸菌不能生长。在葡萄酒正常pH范围内（2.8～4.2）酵母的生长不受影响。

温度是另一个重要的因素，低温抑制细菌、酿酒酵母的生长，当温度低于12℃酿酒酵母的初发酵被抑制。长期低温并添加适量营养物质有利于葡萄汁中野生微生物的生长[21]。

在酿酒酵母大量繁殖之前，醋酸菌、霉菌为需氧菌，有氧气的环境易导致腐败发生。酿酒酵母对氧气的竞争能力很强，当酿酒酵母开始大量繁殖时需适当通风促进酿酒酵母的繁殖。LAB是兼性厌氧菌，氧气促进酿酒酵母生长的同时也对兼性厌氧的LAB的生长有刺激作用。

2.4.2 酿酒操作

酿酒中的操作对葡萄酒中的微生物菌群都会产生影响，如SO2的使用，冷浸、发酵温度、通风、添加营养物质、接种酿酒酵母[22]。卫生状况如设备清洁的频率。其他操作如浸皮、帽处理、浸泡时间都会影响微生物的生长；浆果中的微生物像膜一样附着在浆果表面难以去除，但营养丰富的葡萄汁环境类似于发酵培养基，由分裂产生的新细胞会释放到发酵物中。因此，果皮接触葡萄汁时间的长短影响后代细胞的释放，从而影响葡萄汁中微生物的种类；帽处理中泵数量及种类的选取也会影响葡萄汁中微生物的种类。酒精发酵过程对酒液表面微生物的抑制作用取决于厌氧条件下木桶上方CO2层的形成。如果要丰富葡萄酒中微生物区系，就推迟酿酒酵母的接种，为其他微生物的生长及终产物的产生提供充足的时间。提前添加营养物质会促进非酿酒酵母的繁殖。

2.4.3 微生物的相互作用

葡萄酒中微生物的相互作用包括竞争有限的营养成分和通过代谢产生最终产物抑制其他菌种生长的物质。酵母的代谢产物如酒精可以抑制大多数的细菌、霉菌及一些酵母。当酒精浓度大于7%，非酿酒酵母的生长受到抑制。一些酿酒酵母会产生抑制肽抑制其他酵母菌株。酿酒在缺氧的环境中竞争氧气的能力更强，非酿酒酵母对于缺氧的环境缺乏耐受力，移除多余的氧气使非酿酒酵母更早地死亡。非酿酒酵母在发酵初期可以利用氨基酸及维他命来生长，从而限制了酿酒酵母的生长。在发酵的中后期，死亡及自身溶解的非酿酒酵母的细胞可成为酿酒酵母的营养源[23]。细菌同样可以产生细菌素抑制其他细菌的生长。酒精发酵结束后，自溶的酵母为随后引发MLF的酒酒球菌提供了营养，刺激了酒酒球菌的生长。在活跃发酵期，霉菌几乎不存在。但霉菌产生的霉菌毒素会残留在浆果表面抑制葡萄汁及葡萄酒中的微生物。葡萄钩丝壳菌Uncinula necator污染葡萄产生的蘑菇味在酒精发酵中可消除；酵母细胞壁中尤其是β-葡聚糖对霉菌毒素有吸附的作用[24]。

3 瓶装酒中微生物的控制

已经装瓶的葡萄酒中要防止瓶中微生物的生长代谢从而防止葡萄酒变浑浊、失去风味。腐败微生物包括细菌、酵母、霉菌；细菌包括乳酸菌、醋酸菌、芽孢杆菌、链霉菌。

3.1 细菌造成腐败

LAB（短乳杆菌Lactobacillusbrevis、肠系膜明串珠菌Leuconostocmesenteroides）会降解赖氨酸造成酒液颜色变深，利用组氨酸等氨基酸产生组胺使部分消费者产生头痛；几种菌共同发酵葡萄酒中的糖，产生乳酸、CO2、醋酸、甘油等，使酒具有酸白菜和酸牛奶味，破坏酒的品质。醋杆菌属侵染葡萄酒后会在酒液与空气接触的表面形成一层淡灰色的薄膜，最初是透明的，以后变暗，有时形成带褶皱的玫瑰色薄膜，然后薄膜部分脱落沉人酒液中造成酒体浑浊，发出不良醋酸气味，使酒液的挥发酸含量增高[25]。

苦味芽孢杆菌侵染葡萄酒使之变苦，多发生在红葡萄酒和老酒中。受侵染的葡萄酒中还原糖、酒石酸盐类和甘油含量都减少，总酸、挥发酸含量增加。

3.2 霉菌造成腐败

来自腐败的软木塞中的霉菌，会引起酒的浑浊；代谢产生的2，4，6-三氯苯甲醚使酒液中出现的霉塞味。

3.3 酵母造成腐败

接合酵母对糖有很高的耐受力会产生CO2造成酒的浑浊。毕赤氏酵母也造成酒的浑浊。假丝酵母在酒表面形成一层灰白色或暗黄色的，随时间增厚，并逐渐将酒液覆盖；进而膜破裂，白色碎片下沉并且产生酒精或乙醛。酒香酵母降解赖氨酸，产生纤维素酶将木桶中的纤维素降解为多糖并利用。酿酒酵母在糖分含量高的酒中易造成二次发酵，在瓶中会使酒浑浊、产生CO2[26]。

4 结论

葡萄及周围环境中的微生物具有多样性，葡萄酒的酿造是不同种属的LAB、酵母及真菌共同作用的结果，葡萄汁发酵是由酵母菌群相互作用引起的，酵母菌群与细菌及丝状真菌的相互作用对葡萄酒的品质也有显著的影响。对不同种属间微生物的生理、化学水平及生物化学方面的相互作用需要进一步了解。

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Progress on Microbial Diversity Study in W ine Production

SUNWei-ning，ZHANGQiao-ge，LIXing-xing，HANYe*
（SchoolofChemicalEngineeringand Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China）

The nature ofwinemaking process is the process of complex interactions between yeast、bacteria、filamentous fungi.Thisarticle describes the changesof speciesand quantitiesofmicrobes froMthe collection of grapesuntilwinepostfermentationand the interactionsbtweenmicrobesimpacton themicrobialdiversity.

wine；microbialdiversity；microbial interaction

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.18.098

2014-09-24

孙炜宁（1992—），女（汉），大学本科，研究方向：葡萄酒微生物多样性。

*通信作者