不同豆类细菌型豆豉的功能性成分分析

杨胜远韦锦

（1. 韩山师范学院生物学系，潮州 521041；2. 韩山师范学院图书馆，潮州 521041）

不同豆类细菌型豆豉的功能性成分分析

杨胜远1韦锦2

（1. 韩山师范学院生物学系，潮州 521041；2. 韩山师范学院图书馆，潮州 521041）

对细菌型黄豆豆豉、黑豆豆豉、绿豆豆豉、豌豆豆豉、足豆豆豉、红豆豆豉和赤小豆豆豉的功能性成分进行了分析。结果显示，7种豆豉的水分含量均在45%-55%的范围内；黄豆豆豉、黑豆豆豉、豌豆豆豉和绿豆豆豉具有较强纤溶酶和酰胺酶活性，其中黄豆豆豉的纤溶酶和酰胺酶活力最高，分别为（149.07±6.63）IU/g和（120.07±0.39）U/g；7种豆豉都具有一定［DPPH·］清除能力，清除能力大小为黄豆豆豉 ＞ 黑豆豆豉 ＞ 绿豆豆豉 ＞ 豌豆豆豉 ＞ 足豆豆豉 ＞ 红豆豆豉 ＞ 赤小豆豆豉，黄豆豆豉［DPPH·］清除率达到（98.14±1.01）%；不同豆豉的酸可溶性多肽含量差异较大，黄豆豆豉为（82.79±3.14）mg/g，豌豆豆豉为（42.63±1.17）mg/g，其它5种豆豉的多肽含量均在25-29 mg/g之间；黄豆豆豉、黑豆豆豉、绿豆豆豉和豌豆豆豉的总游离氨基酸含量较高，分别达到了（38.89±2.27）mg/g、（32.91±1.13）mg/g、（27.80±0.79）mg/g和（34.12±1.57）mg/g，而其它3种豆豉的总游离氨基酸含量相对较低，仅为黄豆豆豉的1/2左右。功能性成分分析表明，黄豆是制备细菌型豆豉的最适原料。

豆豉 功能性成分 分析

豆豉始创于中国，原名“幽菽”，古时称大豆为“菽”，据《中国化学史》解释“幽菽”是大豆煮熟后，经过幽闭发酵而成的意思，后更名为豉。据汉刘熙《释名·释饮食》中说：“豉，嗜也，五味调和，须之而成，乃可甘嗜，故齐人谓豆豉，声同豆豉也”。我国的豆豉可分为霉菌型豆豉和细菌型豆豉两大类［1］。霉菌型豆豉有根霉型、米曲霉型及毛霉型豆豉；细菌型豆豉则是利用枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）发酵蒸熟大豆，借助其蛋白酶生产出风味独特的大豆制品［1］。细菌型豆豉不仅可以开胃增食、消食化滞和提高大豆营养素（如矿物质、维生素、大豆异黄酮、氨基酸、多肽等）的消化吸收，而且含有豆豉纤溶酶，具有溶血栓作用［2-6］。

不同豆类在成分上具有较大差异，甚至在蛋白质的一级结构上也有差异，因此经过枯草芽胞杆菌发酵后其营养与功能性成分，也会存在差异。本研究分别以黄豆、黑豆、绿豆、赤小豆、红豆、足豆和豌豆为原料，利用枯草芽胞杆菌枯草亚种（Bacillus subtilissubsp.subtilis）DC8发酵制备不同豆类细菌型豆豉，并对其功能性成分进行分析，以期为科学膳食和新产品研发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

黄豆、黑豆、绿豆、赤小豆、红豆、足豆和豌豆均购自潮州市大福源超市。纤维蛋白原（人源，F3879-1G）、凝血酶（人源，T6884-100UN）、尿激酶（人源，T4010-10KU）和2，2-二苯基-1-苦肼基（2，2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH，D9132-1G）和琥珀酰-丙氨酰-丙氨酰-脯氨酰-苯丙氨酸-4-硝基苯胺（succinyl-alanyl-alanyl-prolyl- phenylalanine- 4-nitroanilide，Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA，S7388-100MG）均为美国Sigma公司产品；巴比妥钠（分析纯），天津市光复精细化工研究所生产；其它试剂均为分析纯或生化试剂。枯草芽胞杆菌枯草亚种（Bacillus subtilissubsp.subtilis）DC8为韩山师范学院生物学系食品与发酵工程研究所从广西乐业县传统细菌型豆豉中分离、鉴定和保藏。

仪器：UV-2550紫外-可见分光光度计，日本Shimadzu公司生产；ART MICCRA D-9智能型分散机，德国ART公司生产；AUW120电子分析天平，日本Shimadzu公司生产；Sigma 3-18K高速冷冻离心机，德国Sigma 公司生产；LRH-250恒温培养箱，上海恒科学仪器有限公司；DGX-9243B-2电热恒温鼓风干燥箱，上海福玛实验设备有限公司。

种子培养基：采用马铃薯液体培养基，制备方法参照文献［7］略作改动。取去皮的马铃薯块200 g，用1 L水煮沸30 min，纱布过滤、冷却，加入葡萄糖20 g，补足水至1 L，调节pH值至7.0-7.2。分装100 mL/250 mL三角瓶，121℃灭菌20 min备用。

1.2 方法

1.2.1 种子液培养 从B. subtilissubsp.subtilisDC8斜面挑取1环接入马铃薯液体培养基，于37℃摇床培养12 h。菌落总数大于108CFU/mL。

1.2.2 细菌型豆豉发酵 选用颗粒饱满、无虫眼和霉变的豆为原料，过筛去杂质后，用约3倍豆体积的可食用水常温浸泡8 h，沥干后盛于250 mL烧杯（豆厚度6 cm），然后于121℃蒸汽蒸煮25 min。冷却，按每千克豆接入40 mLB. subtilissubsp.subtilisDC8种子液，混匀，于37℃恒温培养24 h，然后至于4℃后熟24 h。

1.2.3 豆豉水分含量测定 将豆豉用研钵研成糜状，参照文献［8］采用直接干燥法进行测定。称取（5.000 ± 0.005）g豆豉糜于105℃烘干至恒重，并计算豆豉的水分含量（%）。

1.2.4 纤溶酶和酰胺酶活性的测定

1.2.4.1 粗酶液制备 将豆豉用研钵研成糜状，称取10 g豆豉糜，加入50 mL 生理盐水，25 000 r/min均质2 min，然后置4℃浸提1 h，在4℃于11 180×g高速冷冻离心10 min，取上清液用Φ 0.45μm滤膜过滤作为粗酶液。

1.2.4.2 酶活性测定 纤溶酶活性参照文献［9］采用琼脂糖-血纤维平板法进行测定，根据水分含量换算为单位干质量所具有的纤溶酶活力表示。

酰胺酶活性参照文献［10］略作改进后进行测定，根据水分含量换算为单位干质量所具有的酰胺酶活力表示。取4 mL 0.1 mol/L pH7.8 硼酸缓冲液，加入0.5 mL样品，37℃保温 2min，加入已在37℃保温2 min的0.5 mmol/L Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA溶液（以0.1 mol/L pH7.8硼酸缓冲液配制）0.5 mL，在37℃保温2 min，于405 nm 测定吸收值，计算分解的p-硝基苯胺浓度。以蒸馏水作为参比，以加入酶液样品后立即测定405 nm吸收值作为对照。标准曲线采用10、20、30、40和50 μmol/L的p-硝基苯胺标准溶液405 nm处的吸收值为纵坐标，以p-硝基苯胺浓度为横坐标进行绘制。酶活力单位定义：1 min水解Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA生成1 μmol/Lp-硝基苯胺的酰胺酶酶量为一个酶活力单位（unit，U）。

1.2.5 抗氧化活性测定 将黑豆豆豉用研钵研成糜状，称取4 g黑豆豆豉糜，加入40 mL 50% 乙醇，25 000 r/min均质2 min，在室温下振荡提取1 h，在4℃于11 180×g高速冷冻离心20 min，取上清液参照文献［11］测定DPPH自由基清除能力，根据水分含量换算为单位干质量所具有的DPPH自由基清除率（%）表示抗氧化的能力大小。

1.2.6 总游离氨基酸含量测定 将黑豆豆豉用研钵研成糜状，于80℃烘干，粉碎过40目筛，称取1 g豆豉粉末，加入20 mL蒸馏水，25 000 r/min均质2 min，于40℃浸提15 min，在4℃于11 180×g高速冷冻离心20 min，取上清液参照文献［12］测定总游离氨基酸含量。以单位干质量中总游离氨基酸含量表示。

1.2.7 多肽含量测定 将黑豆豆豉用研钵研成糜状，于80℃烘干，粉碎过40目筛，称取1 g豆豉粉末，加入20 mL蒸馏水，25 000 r/min均质2 min，于40℃浸提15 min，在4℃于11 180×g高速冷冻离心20 min，取上清液与等体积的三氯乙酸（0.4 mol/L）混合，静置1 h后于11 180×g高速冷冻离心20 min，取上清液参照文献［13］采用双缩脲法测定酸可溶性多肽的含量。以单位干质量中酸可溶性多肽含量表示。

2 结果

2.1 不同豆类细菌型豆豉的水分含量

表1显示不同豆类经B. subtilissubsp.subtilisDC8发酵获得的豆豉的含水量存在一定差异，但水分含量在45%-55%的范围内。

2.2 不同豆类细菌型豆豉的纤溶酶活性

表2对不同豆类的菌性豆豉的纤溶酶活性进行了测定，结果表明黄豆豆豉、黑豆豆豉、豌豆豆豉和绿豆豆豉均具有纤溶酶活性，其中以黄豆豆豉的纤溶酶活性最高，以干豆豉计，每克黄豆豆豉的纤溶酶活力达到了（149.07±6.63）IU；而足豆豆豉、红豆豆豉和赤小豆豆豉未检测到纤溶酶活性。

2.3 不同豆类细菌型豆豉的酰胺酶活性

表3表明不同种类的豆豉都具有一定酰胺酶活性，其中以黄豆豆豉的酰胺酶活性最高，达到了（120.07±0.39）U/g。

比较表2和表3，不同豆类细菌型豆豉的酰胺酶活性与其豆豉纤溶酶活性大小顺序基本一致，说明豆豉的酰胺酶活性与纤溶酶活性存在一定相关性，可以通过测定酰胺酶活性反映豆豉的纤溶酶活性。

2.4 不同豆类细菌型豆豉的抗氧化活性

表4显示不同豆类细菌型豆豉都具有一定的DPPH自由基清除能力，说明不同豆类细菌型豆豉都具有一定的抗氧化活性。黄豆细菌型豆豉的DPPH自由基清除能力最强，自由基清除率达到了（98.14±1.01）%，其它细菌型豆豉的DPPH自由基清除能力大小顺序为：黄豆豆豉 ＞ 黑豆豆豉 ＞ 绿豆豆豉 ＞ 豌豆豆豉 ＞ 足豆豆豉 ＞ 红豆豆豉 ＞ 赤小豆豆豉。

2.5 不同豆类细菌型豆豉的酸可溶性多肽含量

对不同豆类细菌型豆豉的酸可溶性多肽含量进行了测定，结果（表5）表明不同豆豉的酸可溶性多肽含量差异较大。黄豆豆豉的多肽含量最高，达到（82.79±3.14）mg/g；豌豆豆豉次之，多肽含量为（42.63±1.17）mg/g；其它豆豉的多肽含量差异不大，主要集中在（25-29）mg/g范围内。

不同豆类细菌型豆豉的多肽含量差异影响因素较多，如不同豆类的蛋白质组成和含量不同、蛋白质与蛋白酶接触情况不一致、不同豆类是否有利于菌种在发酵过程中产蛋白酶等都会影响到豆豉的多肽含量。

2.6 不同豆类细菌型豆豉的总游离氨基酸含量

大豆蛋白在发酵过程中受枯草芽胞杆菌蛋白酶和肽酶作用，一些氨基酸获得释放，既有利于人体对蛋白质的消化吸收，也有利于豆豉风味的形成。

经对不同豆类豆豉的氨基酸进行分析，结果（表6）表明黄豆豆豉、黑豆豆豉、绿豆豆豉和豌豆豆豉的总游离氨基酸含量较高，分别达到了（38.89±2.27）mg/g、（32.91±1.13）mg/g、（27.80±0.79）mg/g和（34.12±1.57）mg/g，而足豆豆豉、红豆豆豉和赤小豆豆豉的总游离氨基酸含量相对较低，含量只约为黄豆豆豉的1/2。

3 讨论

不同豆类的蛋白质含量和组成不同，发酵制备的豆豉功能性因子和营养成分差异较大，其中黄豆豆豉纤溶酶活性、酰胺酶活性、自由基清除能力、酸可溶性多肽和总游离氨基酸含量均最高，因此黄豆是制备细菌型豆豉的最佳原料。一些文献表明黑豆含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素、胡萝卜素、微量元素、粗纤维、异黄酮、黑色素、红色花青素等，黑豆蛋白质中的必需氨基酸组成和含量优于黄豆，居豆类之首［14，15］。理论上黑豆也是细菌型豆豉的良好原料，然而本研究结果表明黑豆豆豉无论是营养成分含量，还是功能性物质活性都没有黄豆豆豉高，这可能是由于黑豆的种皮厚、颗粒大，造成蒸煮和发酵程度不够的原因所引起的，有望通过对黑豆豆豉发酵工艺优化而获得改善。无论从豆豉的风味还是功能性成分角度而言，绿豆、豌豆、足豆、红豆和赤小豆都不适合用于制备细菌型豆豉。

4 结论

不同豆类细菌型豆豉的水分含量均较高，在45%-55%的范围内。

黄豆豆豉、黑豆豆豉、豌豆豆豉和绿豆豆豉具有较强纤溶酶和酰胺酶活性，其中黄豆豆豉的纤溶酶和酰胺酶活力最高，分别为（149.07±6.63）IU/g和（120.07±0.39）U/g。

不同豆类细菌型豆豉都具有一定［DPPH·］清除能力，其中黄豆豆豉［DPPH·］清除能力最强，自由基清除率达到（98.14±1.01）%。

不同豆类细菌型豆豉的酸可溶性多肽含量差异较大，以黄豆豆豉的酸可溶性多肽含量最高，达到了（82.79±3.14）mg/g。

不同豆类细菌型豆豉的总游离氨基酸含量差异较大，以黄豆豆豉的总游离氨基酸含量最高，达到了（38.89±2.27）mg/g。

功能性成分分析结果显示，黄豆是制备细菌型豆豉的最适原料。

［1］ 宋永生, 张炳文. 日本纳豆与中国豆豉营养功能成分的研究进展［J］. 中国调味品, 2004（12）：6-9, 26.

［2］ 赵德安. 豆豉的医疗生理作用［J］. 中国调味品, 1998（7）：9-11.

［3］ 张炳文, 宋永生. 发酵处理对大豆制品中异黄酮含量与组分影响的研究［J］. 食品与发酵工业, 2002, 28（7）：6-9.

［4］ 宋永生, 张炳文. 对豆豉营养与活性成分变化的研究［J］. 食品工业科技, 2003（5）：23-25.

［5］ Wang CT, Ji BP, Nout R, et al. Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme of Bacillus subtilis DC33, isolated from Chinese traditional Dou-Chi［J］. J Ind Microb Biotech, 2006, 33：750-758.

［6］ 高秀丽, 鲍鹏, 张敏, 等. 一种贵州豆豉酶提取物的溶栓活性及溶栓机理研究［J］. 贵阳医学院学报, 2007, 32（4）：362-364.

［7］ 沈萍, 陈向东. 微生物学实验［M］. 第4版. 北京：高等教育出版社, 2007：242.

［8］ 中华人民共和国卫生部. GB 5009.3-2010 食品安全国家标准食品中水分的测定［S］. 北京：中国标准出版社, 2010：1-6.

［9］ 吕凤霞, 陆兆新, 别小妹, 等. Bacillus subtilis γ-DES36 纤溶酶发酵条件的优化研究［J］. 农业工程学报, 2005, 21（2）：175-178.

［10］ Ikeda S, Ohsugi T, Sumi H. Activation of fibrinolysis（Nattokinase）induced by dipicolinic acid and related compounds［J］. Food Sci Technol Res, 2006, 12（2）：152-155.

［11］ 邹磊, 汪立君, 程永强, 等. 加工工艺对豆豉抗氧化能力的影响［J］. 食品科学, 2006, 27（8）：174-177.

［12］ 杨胜远, 洪纳禧. 茶游离氨基酸总量测定方法的改进［J］. 食品科技, 2012（9）：296-300, 305.

［13］ Cotton F, Delobbe E, Gulbis B. Assessment of a biuret method without concentration step for total protein determination in cerebrospinal fluid［J］.Clin Biochem, 1997, 30（4）：313-314.

［14］ 王敏, 李丹, 李荣和, 等. 黑豆营养价值及功能特性应用的研究与进展［J］. 长春大学学报, 2008, 18（1）：104-107.

［15］ 丛建民. 黑豆的营养成分分析研究［J］. 食品工业科技, 2008（4）：262-264, 268.

（责任编辑 李楠）

Functional Ingredients Analysis of Bacterial Lobster Sauce Fermented from Different Beans

Yang Shengyuan1Wei Jin2
（1. Department of Biology，Hanshan Normal University，Chaozhou521041；2. Library of Hanshan Normal University，Chaozhou521041）

The functional ingredients of bacterial soybean lobster sauce（SLS）, black bean lobster sauce（BBLS）, mung bean lobster sauce（MBLS）, pea lobster sauce（PLS）, foot bean lobster sauce（FBLS）, red bean lobster sauce（RBLS）and red phaseolus bean lobster sauce（RPBLS）were investigated. The results indicated the moisture content of the seven kinds of lobster sauce was range 45% to 55%. SLS, BBLS, PLS and MBLS showed strong fibrinolysin activity and amylase activity. The fibrinolysin activity and amylase activity of SLS was（149.07±6.63）IU/g and（120.07±0.39）U/g respectively, which was the highest of the seven kinds of lobster sauce. All of the seven kinds of lobster sauce have DPPH free radical scavenging activity with the order of SLS＞ BBLS＞ MBLS＞ PLS＞ FBLS＞ RBLS＞ RPBLS. The DPPH free radical scavenging activity of SLS was 98.14±1.01%. There was great difference on the content of acid soluble polypeptides between the different kinds of lobster sauce. The content of acid soluble polypeptides of SLS and PLS was（82.79±3.14）mg/g and（42.63±1.17）mg/ g respectively, and the content of acid soluble polypeptides in the other five kinds of lobster sauce was rang 25 mg/g to 29 mg/g. The content of free amino acids of SLS, BBLS, MBLS and PLS was（38.89±2.27）mg/g, （32.91±1.13）mg/g, （27.80±0.79）mg/g and（34.12±1.57）mg/ g respectively, however, the content of free amino acids of the other three kinds of lobster sauce was only about half of that of SLS. The functional ingredients analysis showed that soybean was the most suitable raw materials for lobster sauce.

Lobster sauce Functional ingredients Analysis

2013-10-15

国家级星火计划项目（2011GA780022），韩山师范学院教授科研启动金项目（QD20110304）

杨胜远，男，教授，博士，研究方向：食品微生物及生物技术；E-mail：yshengyuan2004@aliyun.com