基于流感病毒PAN蛋白的高通量药物筛选

张国防李真真姚伟利王丽君朱显明

（1. 天津科技大学生物工程学院，天津 300222；2. 天津市国际生物医药联合研究院，天津 300457；3. 南开大学药学院，天津 300071；4. 南开大学生命科学学院，天津 300071；5. 天津市国际生物医药联合研究院有限公司，天津 300457）

基于流感病毒PAN蛋白的高通量药物筛选

张国防1李真真1姚伟利2，3王丽君2，4朱显明5

（1. 天津科技大学生物工程学院，天津 300222；2. 天津市国际生物医药联合研究院，天津 300457；3. 南开大学药学院，天津 300071；4. 南开大学生命科学学院，天津 300071；5. 天津市国际生物医药联合研究院有限公司，天津 300457）

流感病毒的PAN蛋白高度保守，并且具有核酸内切酶活性，是抗流感药物研发的潜在靶点。通过高通量药物筛选体系，从372种化合物中筛选出3种对流感病毒H5N1的PAN蛋白抑制作用较好的化合物。将这3种化合物分别与PAN蛋白进行分子对接模拟，结果显示它们均可以与PAN蛋白活性位点的二价金属离子和氨基酸残基相互作用，从而为抗流感病毒药物的发现提供了先导化合物。

流感病毒 PAN蛋白 高通量药物筛选 分子对接 化合物

流感是由流感病毒引起的传染性极强的急性呼吸道感染。20世纪以来，全球发生过多次大规模的流感疫情。由于流感病毒容易发生基因重组而导致抗原变异，人体的免疫系统不能有效抵御病毒的攻击，因此每一次周期性的流感爆发都会给人类健康和养禽业造成严重危害。流感病毒可以借助空气或者接触传播，传播迅速并且波及范围广泛，曾经爆发的H5N1高致病性禽流感病毒突破种属天然屏障，已经被证实了具有有效的人-人传染的能力，感染人时致死率高达63%［1-3］。2013年3月底，我国上海和安徽两地率先发现3例人感染H7N9禽流感病例。据国家卫生和计划生育委员会统计数据，截至2013年8月31日，我国内地共报告134例人感染H7N9禽流感确诊病例，其中死亡45人，康复86例，分布于12个省市的42个地市。目前，能够有效治疗流感的药物非常有限，寻找新的药物靶标，研究新的抗流感药物是药物研发领域亟待解决的重要问题之一。

流感病毒属于正黏病毒科（Orthomyxoviridae）流感病毒属的一类RNA病毒［4］，其RNA聚合酶（RNA polymerase）存在于被感染者宿主细胞的细胞核中，由PB1、PB2和PA三个蛋白质亚基组成。PA亚基是一种酸性蛋白，在流感病毒RNA聚合酶中分子量最小。研究发现PA亚基具有丝氨酸蛋白酶活性和核酸内切酶活性，参与病毒复制、转录及组装等多个生命过程。PA亚基可以被胰蛋白酶切割成30 kD的PAN（1-256）和55 kD的PAC（257-756），其中PAN蛋白的二级序列由7个α螺旋、5个β折叠及一些无规卷曲组成，具有与5'帽子结构和cRNA启动子结合，稳定聚合酶等多种功能。更重要的是PAN蛋白具有核酸内切酶常见的（P）DXN（D/E）XK序列，其核酸内切酶活性口袋部位存在His41、Glu80、Lys134、Asp108、Glu119五个关键氨基酸残基，这5个氨基酸残基在各种禽流感病毒中高度保守［5，6］，因此PAN被认为是新型抗流感药物研发的潜在靶点［5-7］。本研究通过高通量药物筛选的方法，从372种化合物中筛选出来3种对流感病毒H5N1的PAN蛋白具有抑制作用的化合物，旨在为抗流感病毒药物的研发提供先导化合物。

1 材料与方法

1.1 材料

pGEX-6P-1由天津市国际生物医药联合研究院高通量分子药物筛选中心提供，作为表达载体用。菌株：感受态细胞E.coliDH5α、E.coliBL21（DE3）pLysS购自于北京全式金生物技术有限公司。基因：PAN基因来自于流感病毒A / goose / Guangdong / 1 / 96（H5N1），含有该目的基因的质粒由高通量分子药物筛选中心构建并保存。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒构建及蛋白纯化 以含有流感病毒H5N1的PAN基因的质粒作为模板，使用Primer premier 5.0软件设计引物，5'端引物为CGCGGATCCATGGAAGACTTTGTGC，3'端引物为CCGCTCGAGTTATCTGGCGTTTACTT。扩增后的PCR产物和pGEX-6P-1载体使用BamH I和XhoI双酶切后进行连接。重组质粒经基因测序后转化E.coliBL21（DE3）pLysS感受态细胞。挑取单克隆至5 mL含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，于37℃，220 r/min摇床培养8 h后按0.6%接种量接种到800 mL LB培养基中，相同条件下培养至OD600为0.6-0.8，将摇床降温至16℃，加入400 μL 1 mol/L的IPTG溶液诱导后继续培养16 h，离心收集菌体（4℃，5 500 r/min）。使用30 mL 4℃预冷的1×PBS（pH8.0）重悬菌体，超声破菌40 min（320 W，4℃），4℃，1 5000 r/min离心，收集含有目的蛋白的上清液。

按照Glutathione Sepharose 4 Fast Flow（GE Healthcare）亲和层析介质使用说明方法进行重组PAN蛋白的初步纯化。将含有目的蛋白的上清液通过层析柱，然后用1×PBS（pH8.0）冲洗杂蛋白后，向层析柱中加入100 μL 104U/mg PreScission蛋白酶，于4℃，100 r/min摇床酶切12 h，将目的蛋白从GST标签上切下。用20 mL PAN蛋白缓冲液（20 mmol/L Tris pH8.0，150 mmol/L NaCl）洗脱PAN目的蛋白。使用Superdex 200 10/300 GL凝胶过滤层析柱（GE Healthcare）进一步纯化目的蛋白，收集蛋白样，进行SDS-PAGE检测。

1.2.2 高通量药物筛选 流感病毒PAN蛋白是广谱的金属依赖型核酸内切酶，既可以切割单链DNA、RNA，也可以切割双链的DNA、RNA。这种非特异性的识别和切割活性需要二价金属离子的参与，研究表明Mn2+的结合要优于Mg2+［8，9］。EDTA是金属离子螯合剂，可以螯合Mn2+，从而导致PAN蛋白不能发挥核酸内切酶活性。基于这一原理，采用体外荧光检测和琼脂糖凝胶电泳检测两种药物筛选方法对化合物库进行PAN蛋白的药物筛选。

1.2.2.1 体外荧光检测方法进行药物筛选 基于荧光共振能量转移方法［10，11］，设计了AA核酸片段，在该片段5'端标记FAM荧光基团，在3'端标记BHQ1荧光淬灭基团，即以FAM 5'-AA-3'BHQ1作为PAN的酶切底物，通过抑制率检测药物对酶的抑制作用，通过荧光淬灭率排除假阳性结果，通过IC50值检测PAN蛋白活性被抑制一半时抑制剂的浓度。以阴性对照的酶活曲线最大斜率值为酶促反应速率V0，加入药物后酶活曲线最大斜率值为酶促反应速率Vi，抑制率（Ir）的表示方式如下：

抑制率（Ir）的检测：在96孔板中加入15 μL 0.5 mg/mL的PAN蛋白溶液、15 μL 10 mmol/L MgCl2和MnCl2溶液、9 μL 20 mmol/L Tris-HCl，pH8.0溶液、1 μL 50 mg/mL待测化合物和10 μL 30 μmol/L FAM 5'-AA-3'BHQ1底物；阴性对照中，将1 μL待测样品换成1 μL 95% DMSO；阳性对照中，将1 μL待测样品换成1 μL 0.5 mmol/L EDTA溶液；震荡混匀，酶标仪在激发光为492 nm时，间隔30 s在发射光波长527 nm处测20次荧光值。

荧光淬灭率（Qr）的检测：在96孔板中依次加入15 μL 10 mmol/L氯化镁和氯化锰溶液、24 μL 200 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0、10 μL 30 μmol/L底物（5’FAM-AA），震荡混匀，在激发光和发射光波长分别为492 nm和527 nm处，间隔30 s测20次荧光值，所测荧光值记为Q1；在待测孔中加入1 μL 50 mg/mL药物，在对照孔中加入1 μL 95% DMSO。震荡混匀，酶标仪在激发光为492 nm时，间隔30 s在发射光波长527 nm处测20次荧光值，所测荧光值记为Q2；荧光淬灭率的计算式为：

IC50值的检测：将筛选出来的抑制作用较大的药物依次稀释成16个不同的浓度梯度，在这些浓度下检测该抑制剂对PAN蛋白活性抑制一半时的浓度，最后以抑制剂浓度的对数值为横坐标，剩余活性（Ra）为纵坐标，利用GraphPad Prism 5软件将这些点进行拟合，计算出该抑制剂的IC50值。

1.2.2.2 琼脂糖凝胶电泳进行药物筛选 琼脂糖凝胶电泳药物筛选以pGEX-6P-1质粒为底物，当加入PAN蛋白，其发挥核酸内切酶活性，质粒将被切散，琼脂糖凝胶电泳显示弥散条带。当体系中同时加入药物和PAN蛋白后，若药物对PAN蛋白的核酸内切酶活性有抑制作用，则琼脂糖凝胶电泳显示质粒未被切割的状态，若无抑制作用，则琼脂糖凝胶电泳显示弥散条带。

在1.5 mL EP管中分别加入2 μL 0.5 mg/mL PAN蛋 白、2 μL 10 mmol/L MgCl2和MnCl2溶 液、1 μL 200 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0、1 μL 50 mg/mL的 待测样品；阴性对照中，将1 μL待测样品换成1 μL 95%DMSO；阳性对照中，将1 μL待测样品换成1 μL 0.5 mol/L EDTA；各组分混匀后于37℃孵育10 min。每个EP管中加入4 μL 200 ng/μL的pGEX-6P-1质粒，混匀后于37℃孵育30 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测质粒存在状态。

1.2.3 抑制剂与蛋白质分子对接的验证 分子对接（Mocular docking）是计算机辅助药物设计（Computer aided drug design，CADD）常用的方法之一。利用计算化学原理模拟化合物分子与受体生物大分子的相互作用，分析已知化合物和药物靶标之间的构效关系（Structure activity relationship，SAR），从而设计结构新颖的先导化合物［12，13］。

2 结果

2.1 质粒的构建和蛋白表达的鉴定

771 bp的PAN目的基因和4.9 kb的表达载体连接后转入E.coliDH5α中，阳性单克隆提取质粒后用BamH I和XhoI双酶切鉴定（图1）显示，4.9 kb的载体条带和771 bp的目的基因条带，确定重组成功。利用GST亲和层析柱进行PAN蛋白的初步纯化，经过Superdex 200 10/300 GL预装柱进行凝胶过滤层析进一步纯化，得到大小为30 kD的PAN蛋白（图2）。

2.2 高通量药物筛选结果

2.2.1 荧光检测法筛选结果 对化合物库中的372种化合物进行体外荧光检测，结果如表1所示。抑制率越高，荧光淬灭率越低的化合物对PAN蛋白抑制作用越强。其中Ir≥80%，Qr≤30%的化合物共有8种，分别为MDCCCL001302，MDCCCL001311，JYCCL002021，MDCCCL002107，MDCCCL001315，MDCCCL001316，MDCCCL001319，MDCCCL001320。

2.2.2 IC50检测结果 将荧光检测中Ir≥80%，Qr≤30%的8种化合物进行IC50的测定，如图3所示，化合物MDCCCL001302，MDCCCL001311，JYCCL-002021，MDCCCL002107，MDCCCL001315，MDCCCL001316，MDCCCL001319，MDCCCL001320的IC50值分别为56、143、135.2、149.3、35.5、83.3、125.5、125.5 μmol/L。

2.2.3 琼脂糖凝胶电泳检测结果 通过琼脂糖凝胶电泳检测荧光法中Ir≥80%，Qr≤30%的8种化合物对PAN蛋白的抑制活性，结果如图4所示。由于质粒基本形态可分为3类：超螺旋，线形和开环，所以抽提的质粒电泳检测时可能会出现一条或多条条带。从图4中可以看到加入化合物MDCCCL001302（泳道3）、MDCCCL001315（泳道7）、MDCCCL001316（泳道8）后，质粒在凝胶中的状态同原始质粒（泳道0）和阳性对照（泳道2）相同，为两条条带，表明这些化合物的加入抑制了PAN蛋白的核酸内切酶活性。其他5种化合物加入后，质粒在凝胶中的状态同阴性对照（泳道1）相同，呈弥散条带，表明这些化合物的加入对PAN蛋白的核酸内切酶活性无明显抑制作用。

2.2.4 综合筛选结果 综合体外荧光检测和琼脂糖凝胶电泳检测两种方法筛选结果和IC50值，筛选出来3种对PAN蛋白有较强抑制作用的化合物， 分 别 为MDCCCL001302、MDCCCL 001315、MDCCCL001316，综合筛选结果见表2。

2.2.5 抑制剂与蛋白质的分子对接结果 2012年文献报道了PAN蛋白与EGCG共晶结果（PDB ID：4AWM）［14］，如图5-A所示，证实了EGCG具有较强的PAN核酸内切酶抑制作用，其没食子酰基是必需基团，可以与活性口袋很好地契合，而且没食子酰基的羟基氧可以与活性口袋处的亲水性氨基酸形成稳定的氢键，从而抑制了PAN蛋白的核酸内切酶活性。

将筛选出来的3种化合物分别与PAN蛋白进行分子对接，如图5-B、图5-C和图5-D所示。与EGCG对比发现：化合物MDCCCL001315和MDCCCL001316的共同结构特征是含有3，4-二羟基苯丙烯基，其苯环上邻位的两个羟基氧与活性中心的锰离子之间形成配位键，同时也可以作为氢键受体或供体与其他基团（如羰基氧）协同作用，同活性口袋内的关键氨基酸残基（His41、Glu80、Lys134、Asp108、Glu119）之间形成氢键，从而抑制PAN蛋白核酸内切酶活性。如MDCCCL001316苯环上邻位的两个羟基氧与两个锰离子形成配位键，其中一个羟基氧与Glu119形成氢键，锰离子通过吸电子使底物局部显正电，配位键的产生则减弱了吸电子作用，导致底物不能被降解，从而抑制PAN蛋白核酸内切酶活性。而MDCCCL001302也含有3，4-二羟基苯丙烯基，但是与两个锰离子形成配位键的是羧酸上的羰基氧和羟基氧，同时其苯环上的一个羟基氧与Val121形成氢键，锰离子通过吸电子使底物局部显正电，配位键的产生则减弱了吸电子作用，导致底物不能被降解，从而抑制PAN蛋白核酸内切酶活性。

3 讨论

本试验使用的高通量药物筛选技术是将化学、基因组研究、生物信息，以及自动化仪器等先进技术有机组合在一起，形成的一个高程序、高自动化的新模式，是新药发现的新程序。高通量筛选技术以微孔板为试验工具，利用计算机自动化操作系统实时监测、收集试验数据并对样品数据进行分析处理，具有微量、灵敏、快速、高效等特点。除了本试验使用的荧光共振能量转移（FRET）检测和荧光淬灭（FQ）检测外，还有时间分辨荧光（TRET）、荧光偏振（FP）及荧光相关谱（FCS）等检测手段。本试验使用FRET和FQ快速从372种化合物中筛选出对PAN有抑制作用的化合物。

默克公司利用药效团和计算机模拟发现了一类2，4-二氧戊烷丁酮酸系列化合物，例如，DPBA对核酸内切酶的IC50在0.2-29 μmol/L之间；L-742，001是其结构衍生物，不但能够抑制病毒mRNA的合成，同时还可以有效阻止药物被移除后流感病毒的再生，细胞试验发现它是剂量依赖型的抑制剂，是一个较有潜力的候选药物。对比该系列化合物，本试验通过高通量药物筛选得出的3种化合物在分子对接的验证上，发现了一类3，4-二羟基苯丙烯基的化合物，分别为MDCCCL001302、MDCCCL001315、MDCCCL001316，它们的IC50分别是56 μmol/L，35.5 μmol/L，83.3 μmol/L。这些化合物对PAN蛋白具有明显的抑制作用，是发现抗流感病毒药物的先导化合物，需要进行进一步的结构优化。

4 结论

表达纯化获得了流感病毒H5N1的PAN蛋白，通过高通量药物筛选体系，从372种化合物中筛选出3种对PAN蛋白有抑制作用的化合物，其IC50值分别是56 μmol/L，35.5 μmol/L和83.3 μmol/L。其中3，4-二羟基苯丙烯基在抗流感病毒核酸内切酶活性中具有十分重要的作用。

［1］ Webby RJ, Swenson SL, Krauss SL, et al. Evolution of swine H3N2 influenza viruses in the United States［J］. Journal of Virology, 2000, 74（18）：8243-8251.

［2］ Karasin AI, Schutten MM, Cooper LA, et al. Genetic characterization of H3N2 influenza viruses isolated from pigs in North America, 1977-1999：evidence for wholly human and reassortant virus genotypes［J］. Virus Research, 2000, 68（1）：71-85.

［3］ Li KS, Guan Y, Wang J, et al. Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia［J］. Nature, 2004, 430（6996）, 209-213.

［4］ Couceiro JN, Paulson JC, Baum LG. Influenza virus strains selectively recognize sialyloligosaccharides on human respiratory epithelium；the role of the host cell in selection of hemagglutinin receptor specificity［J］. Virus Research, 1993, 29（2）：155-165.

［5］ Yuan P, Bartlam M, Lou Z, et al. Crystal structure of an avian influenza polymerase PANreveals an endonuclease active site［J］. Nature, 2009, 458（7240）：909-913.

［6］ Liu Y, Lou Z, Bartlam M, et al. Structure-function studies of the influenza virus RNA polymerase PA subunit［J］. Science in China Series C：Life Sciences, 2009, 52（5）：450-458.

［7］ Nistal-Villán E, et al. New prospects for the rational design of antivirals［J］. Nature Medicine, 2009, 15（11）：1253-1254.

［8］ Crépin T, Dias A, et al. Mutational and metal binding analysis of the endonuclease domain of the influenza virus polymerase PA subunit［J］. Journal of Virology, 2010, 84（18）：9096-9104.

［9］ Dias A, Bouvier D, Crépin T, et al. The cap-snatching endonuclease of influenza virus polymerase resides in the PA subunit［J］. Nature, 2009, 458（7240）：914-918.

［10］ Sinev M, Landsmann P, Sineva E, et al. Design consideration and probes for fluorescence resonance energy transfer studies［J］. Bioconjugate Chemistry, 2000, 11, （3）：352-362.

［11］ Gauglitz G, Proll G. Strategies for label-free optical detection［J］. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, 2008, 109：395-432.

［12］ 徐筱杰, 侯廷军, 乔学, 等. 计算机辅助药物分子设计［M］.北京：化学工业出版社, 2004.

［13］ 李洪林, 沈建华, 罗小民, 等. 虚拟筛选与新药发现［J］. 生命科学, 2005, 17（2）：125-131.

［14］ Kowalinski E, Zubieta C, Wolkerstorfer A, et al. Structural analysis of specific metal chelating inhibitor binding to the endonuclease domain of influenza pH1N1（2009）Polymerase［J］. PLOS Pathogens, 2012, 8（8）. e1002831.

（责任编辑 李楠）

High Throughput Drug Screening on Protein PANof Influenza Virus

Zhang Guofang1Li Zhenzhen1Yao Weili2，3Wang Lijun2，4Zhu Xianming5
（1. College of Biology Enginzeering，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300222；2. Tianjin International Joint Academy of Biotechnology & Medicine，Tianjin 300457；3. College of Pharmacy，Nankai University，Tianjin 300071；4. College of Life Science，Nankai University，Tianjin 300071；5. Tianjin International Joint Academy of Biotechnology & Medicine Company Limited，Tianjin 300457）

PANprotein, which is an endonuclease and highly conserved in influenza virus, is a potential target for the discovery and development of anti-influenza drugs. Three inhibitors of PANprotein were obtained from a compounds library. The molecular docking analysis showed that these compounds can interact with the divalent metal ions and those amino acid residues in the active sites, implying that these components might be the lead compounds for the novel anti-influenza drugs.

Influenza virus Protein PANHigh throughput screening Molecular docking Compounds

2013-07-30

天津市科技支撑计划国家生物医药国际创新园专项（12ZCZDSY13500）

张国防，男，硕士研究生，研究方向：生物工程；E-mail：guofang.zhang@htmdc.org

朱显明，男，硕士，助理实验师，研究方向：生物医药；E-mail：xianming.zhu@htmdc.org