pH对米根霉发酵厨余垃圾生产L-乳酸的影响

周群 盛莉

（上海理工大学 实验室管理与服务中心，上海 200093）

pH对米根霉发酵厨余垃圾生产L-乳酸的影响

周群 盛莉

（上海理工大学 实验室管理与服务中心，上海 200093）

为了强化厨余垃圾发酵L-乳酸的产量和光学纯度，研究了pH对米根霉AS3.819发酵厨余垃圾生产乳酸及其光学特性的影响。结果表明，在中温条件下（34℃），米根霉生长的最适pH为7，最适发酵条件为8。用米根霉发酵非灭菌的厨余垃圾生产乳酸，发酵液中还原糖浓度低，且呈先升高，后下降到最低的趋势。pH 调节到近中性和偏碱性（pH6、7、8）的各组还原糖浓度高于偏酸性组（pH 5和对照组）。控制pH为8时，总乳酸产生速率达1 g/（L·h），L-乳酸是主要的异构体形式，L-乳酸在总乳酸中的比例在整个发酵时间段内都保持在0.75以上，L-乳酸浓度最高达到59.8 g/L，L-乳酸光学纯度可达到0.99。控制pH为8时，可以同时获得高的乳酸产量和光学纯度。

厨余垃圾 米根霉AS3.819 还原糖 L-乳酸 光学纯度

厨余垃圾是居民在生活消费过程中形成的一种生活废物，仅上海市每天的产生量就达1 300余 t。厨房垃圾主要包括米和面粉类食物残余、蔬菜、植物油、动物油、肉骨、鱼刺等，从化学组分来分，有淀粉、纤维素、蛋白质、脂类、和无机盐等。与其它垃圾相比，厨余垃圾含水量高，不适于焚烧处理，且易腐败发臭，因此急需处理厨房垃圾的新技术［1-3］。1999年日本学者Shirai［4］提出了一种实现厨房垃圾减量化、无害化和资源化的新途径，即通过发酵厨房垃圾生产乳酸，进而可以合成聚乳酸这种可生物降解性塑料［5］。不仅可以解决厨余垃圾的资源化问题，还有利于可生物降解塑料早日取代通用塑料，有望解决困扰人类多年的白色污染难题。

乳酸，特别是L-乳酸在食品、医药、化工等行业应用广泛，聚L-乳酸在解决白色污染和医用生物材料等方面有巨大需求，因此，L-乳酸未来的需求十分巨大。据估计，我国未来20年至50年内，L-乳酸在传统应用领域预计将达到5-8万t，聚乳酸的潜在市场将达250万t以上，与之匹配的L-乳酸的需求量将达到350-400万t（每生产1 t聚乳酸，需耗用乳酸1.5 t左右）。L-乳酸作为合成聚乳酸的底物，将成为我国又一新的大宗生物发酵产业，将是继我国柠檬酸、味精、饲料赖氨酸后最具规模化的生物发酵产业之一，其前景将比已有的发酵产业更为看好［6］。我国经过“九五”科技攻关和“863”计划的支持，已基本具备了生产聚乳酸产品的技术，但是由于目前L-乳酸生产成本高、质量低，限制了L-乳酸的大规模生产。为了提高我国L-乳酸产品的国际竞争力和市场占有率，高质量、低成本的L-乳酸生产技术是目前急需解决的重要课题。因此，不断改进乳酸发酵工艺技术势在必行［7］。

米根霉由于具有发酵产物L-乳酸光学纯度高、营养需求简单、生产成本低、菌丝体大、可直接利用淀粉发酵等优点，而成为高光学纯度L-乳酸的主要生产菌种［8］。由于淀粉是厨余垃圾的主要碳源物质，因此以解淀粉米根霉AS3.819作为菌种，将有利于厨余垃圾的乳酸发酵。本试验研究了pH对米根霉AS3.819发酵厨余垃圾生产乳酸及其光学纯度的影响，旨在强化厨余垃圾的L-乳酸发酵，提高L-乳酸光学纯度。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 厨余垃圾来源及特性 厨余垃圾来自上海理工大学第六食堂，主要成分包括米饭、蔬菜、肉类和豆腐，面条等。取来的厨余垃圾先经过粉碎机粉碎，再经过大孔径（孔径0.5 cm）陶瓷过滤器过滤。厨余垃圾的主要性质见表1。

1.1.2 菌种培养 米根霉AS3.819，购于中科院微生物所菌种保藏中心。悬液制备［7］：PDA平板培养米根霉至长出孢子，刮取长有孢子的菌丝至装有无菌水的三角瓶中，加入无菌玻璃珠震荡，用塞棉花的无菌漏斗过滤，收集滤液，调整孢子浓度至107/ mL。

1.2 方法

1.2.1 试验条件和操作 取100 g 粉碎后的垃圾加入150 mL水，装入500 mL具塞三角瓶中。接种量为10%。用10%的NaOH或2 mol/L的HCL调节pH至设定值（pH为5、6、7、8）；对照反应瓶不调节pH和不加入缓冲溶液；三角瓶放于振荡器中培养，培养温度设定为34℃，转速设为100 r/min。每10 h测定培养液pH及取样测定培养液化学组成。

1.2.2 分析方法 TS、DS、SS、VS与PH用APHA标准方法检测［9］。还原糖用3，5-二硝基水杨酸比色法测定［10］。乳酸用装有手性分离柱Astec CLC（Dikma，USA）的高效液相色谱Agilent 1200测定，流动相为5 mmol/L CuSO4溶液，流量1 mL/min［3］。

1.2.3 置信度 有限次数测定真值与平均值之间有如下关系：

其中，s为标准偏差；n为测定次数；t为选定的某一置信度下的几率系数（统计因子）。本试验的置信度为95%，所有试验的结果代表3次试验的平均值。

2 结果

2.1 细胞生长最适pH的探究

在不同pH的100 mL种子培养液（培养液成分（g/L）：葡萄糖20，硫酸铵4，磷酸二氢钾0.3，七水硫酸锌0.05，硫酸镁0.3，pH自然。将培养基装入三角瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20 min）中，放入10 mL米根霉菌种，培养温度设定为34℃，转速设为100 r/min，培养80 h，观测其生长曲线，结果如图1所示。从图1中可以看出，米根霉生长最适pH为7，最适生长pH范围为6-8，pH小于6与高于8，菌体生长就会受到抑制。

2.2 乳酸发酵最适pH的探究

2.2.1 还原糖 图2 显示了不同pH条件下，厨余垃圾发酵液中还原糖浓度的变化。从图2可以看出，在各pH条件下，还原糖浓度均表现出先升高到最高然后下降到最低的趋势，在30-60 h时间段内，pH为6、7、8的3组发酵液中还原糖浓度要明显高pH为5以及不调节pH的组。pH等于8时在整个发酵时间段内发酵液中还原糖含量最大。

2.2.2 乳酸 图3显示了不同pH条件下乳酸浓度的变化，在80 h的发酵时间内，不同pH条件下，乳酸浓度增长趋势为：在0-10 h内缓慢增加，10-60 h内快速增加至最高点，60 h后基本维持稳定。从图3中看出，乳酸最高浓度出现在pH8组，最高浓度为60 g/L，60 h内乳酸产生速率为1 g/（L·h）。

2.2.3 L-乳酸的光学特性 如图4所示，乳酸的两个光学异构体L-乳酸和D-乳酸，在各pH条件下，发酵的前期0-60 h时间段内，L-乳酸浓度持续增加，D-乳酸浓度不断减少。 pH为7，8组，整个发酵过程中L-乳酸浓度都比较高，D-乳酸浓度在整个发酵过程中都很低，尤其是越到发酵后期D-乳酸浓度越低，到发酵结束时几乎为零。pH8时，乳酸光学纯度从最初的0.75达到最终的0.99。

3 讨论

pH对于微生物的生命活动影响很大，主要通过几个方面实现：一是使蛋白质、核酸等生物大分子所带电荷发生变化，从而影响其生物活性；二是引起细胞膜电荷变化，导致微生物细胞吸收营养物质能力改变；三是改变环境中营养物质的可给性及有害物质的毒性［11］。微生物通常可在一个较宽pH范围内生长，并且远离它们的最适pH，但它们对pH变化的耐受性也有一定限度。细胞质中pH突然变化会破坏质膜、抑制酶活性及影响膜运输蛋白的功能，从而对微生物造成损伤，环境中pH的变化会改变营养物质分子的电离状态，降低它们被微生物利用的有效性［12］。每种微生物都有其最适pH和一定的pH范围，在最适范围内酶活性最高，如果其他条件适合，微生物的生长率也最高。 随着环境pH值的不断变化，使得微生物继续生长受阻，当超过最低或最高pH值时微生物就死亡［13］。同一种微生物由于培养液pH值的不同，可能积累不同的代谢产物［14］。米根霉L-乳酸发酵过程因产生L-乳酸而使pH不断降低，因此有必要对发酵过程中的pH进行调节。以达到强化厨余垃圾的L-乳酸发酵，提高L-乳酸光学纯度的目的。

本试验利用6 mol/L的NaOH和HCl调节pH，探究了细胞生长最适pH，乳酸发酵最适pH。细胞生长的最适pH为7，最适生长范围是6-8，因此选择细胞发酵的pH范围为5，6，7，8。鉴于pH为9时菌体生长严重受阻，且需要利用大量NaOH来调节，所以发酵试验没有选择pH为9的条件进行试验。

pH为6，7，8各组还原糖浓度高于pH为5组和对照组，这是由于pH偏中性和碱性有利于微生物的合成代谢，有利于碳水化合物的水解过程［15，16］。

pH调节为碱性组乳酸浓度明显高于pH中性、酸性与对照组。表明在中温条件下，控制pH为碱性有利于米根霉发酵厨房垃圾乳酸的生成。在30-60 h内，pH为6，7，8各组较高的还原糖产生量保证了乳酸较高的产生速率。

乳酸脱氢酶具有立体异构性，有L-乳酸脱氢酶和D-乳酸脱氢酶，因此乳酸具有L-乳酸和D-乳酸两个光学异构体［17］。在以米根霉AS3.819为主导菌种的非灭菌发酵系统中，还包含着其他多种微生物种群，这种微生物种群结构以及环境条件会影响L-乳酸的光学纯度。试验表明pH为7，8时，整个发酵过程中L-乳酸浓度都比较高，D-乳酸浓度在整个发酵过程中都很低，尤其是越到发酵后期D-乳酸浓度越低，到发酵结束时几乎为零。这表明碱性条件发酵会提高L-乳酸的光学纯度。现行的工业生产上，应用最广的是乳酸菌，这是因为它生长速度快，产酸率高，耐酸性强而且厌氧发酵可大规模降低能耗等优点［18］。但在乳酸菌发酵生产乳酸时，经常混入带有消旋酶的其他菌，使产生的L-乳酸消旋化，难以制得高纯度的L-乳酸［8］。本试验利用不灭菌的厨余垃圾发酵，接种米根霉AS3.819，在中温条件下选择最优pH进行发酵，强化了厨余垃圾的L-乳酸发酵。发酵过程中不仅省略了灭菌过程，简化了生产工艺，而且在实际生产中节约了大量的冷却水。本试验表明，pH控制为8可同时获得较高的L-乳酸产量和光学纯度，这对厨余垃圾的工艺优化具有重要参考价值。

4 结论

米根霉菌体在不同pH的种子培养液中培养，米根霉生长最适pH为7，最适生长pH范围为6-8。

采用接种米根霉AS3.819的非灭菌厨余垃圾发酵产乳酸，发酵液中还原糖浓度低且均呈先升高，后下降到最低的趋势。pH为8时总乳酸产量最大，最高浓度为60 g/L，60 h内乳酸产生速率为1 g/L。

控制pH为碱性时，L-乳酸是主要的异构体形式，并且越到发酵后期光学纯度越高。控制pH为8时，L-乳酸光学纯度可达到0.99。

在中温条件下，为同时获得高的乳酸产量和光学纯度，最优的pH应调节为8。

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（责任编辑 李楠）

Effect of pH on Yield of Lactic Acid from Kitchen Wastes Fermentation by Rhizopus Oryzae AS 3.819

Zhou Qun Sheng Li
（Collge of Science，University of Shanghai for Science & Technology，Shanghai 200093）

In order to realize resource recycling of kitchen waste, the enhancement of fermentative production of lactic acid（LA）byRhizopus oryzaeAS 3.819 was investigated. Batch experiments were carried out to analyze the effect of pH on the yield of total lactic acid and the distribution of L- and D-lactic acid among total lactic acid during the non-sterilized fermentation of kitchen wastes byrhizopus oryzaeAS 3.819. The results showed that whenrhizopus oryzaewas cultured in medium temperature（34℃）, the optimal growth condition was pH 7, the optimal fermentation condition was pH8. The concentration of reduced sugar（calculated as glucose）was low, and its concentration was higher at neutral and alkali conditions（pH6-8）than at acidic conditions（non-controlled pH and pH5）. The L-lactic acid was the predominant isomer form at pH 8. The maximum total lactic acid production rate was 1g/（L·h）, the ratio of L-lactic acid kept at above 0.75 during the whole experimental fermentation time and reached the maximum value（0.99）at 60 h and the maximum L-lactic acid was 59.8 g/L. To obtain high L-lactic acid yield and optical purity simultaneously, it was suggested that PH should be controlled at 8.

Kitchen refuseRhizopus oryzaeAS 3.819 Reduced sugar L- lactic acid Optical purity

2013-09-17

周群，女，教师，研究方向：生物仿生学；E-mail：pingguotubao@aliyun.com

盛莉，女，硕士研究生，研究方向：光学；E-mail：shenglizaiwang1233@163.com