利用不同启动子控制木糖代谢关键酶基因构建可共代谢葡萄糖木糖重组酿酒酵母

金怡 王震 莫春玲 杨秀山 田沈

（首都师范大学 生命科学学院，北京 100048）

利用不同启动子控制木糖代谢关键酶基因构建可共代谢葡萄糖木糖重组酿酒酵母

金怡 王震 莫春玲 杨秀山 田沈

（首都师范大学 生命科学学院，北京 100048）

利用不同强度的启动子调控木糖代谢关键酶活性，构建稳定代谢葡萄糖和木糖产乙醇的重组酿酒酵母。以本实验室专利菌株Saccharomyces cerevisiaeY5为宿主菌，将树干毕赤酵母Pichia stipitisCBS6054的木糖还原酶基因XYL1和木糖醇脱氢酶基因XYL2置于磷酸甘油酸激酶基因启动子（PGKp）控制下，酿酒酵母Y5内源的木酮糖激酶基因XKS1分别由己糖激酶基因启动子（HXK2p）及其内源启动子（XKS1p）控制。这3个基因连同各自表达元件导入宿主细胞中，打通其木糖上游代谢途径。酶活测定结果显示，HXK2p对木酮糖激酶表现出更强的启动效率。重组菌Y5-X3-1中木糖还原酶/木糖醇脱氢酶/木酮糖激酶（XR/XDH/ XK）的酶活比值为1∶5∶4，其木糖消耗量是宿主菌的5倍，最高乙醇产量为24.35 g/L，达到理论值的73%。结果表明，通过调节XYL1、XYL2及XKS1启动子的强度，调控其表达水平，进而改变3种酶的活性水平，对于提高重组酿酒酵母利用木糖发酵产乙醇有明显效果。

重组酿酒酵母 木糖 乙醇 共发酵 启动子

以各类农林废弃物为代表的木质纤维素为原料生产燃料乙醇，具有广阔的应用前景。木质纤维素类原料中半纤维素组分的有效利用可以使乙醇燃料的生产成本降低25%，这主要归功于其中的木糖。木糖是自然界中含量仅次于葡萄糖的糖分，木糖的有效利用提高了植物原料生产乙醇的经济效益，因而对木糖生物转化的研究是充分开发利用半纤维素的基础［1］。

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是工业上生产乙醇的优良菌株，具有许多优秀的生产性能［2］。但酿酒酵母不能有效地利用木质纤维素中含量次丰富的木糖［3］。国内外广泛采用能天然代谢木糖产乙醇的树干毕赤酵母（Pichia stipitis）作为木糖还原酶（XR）和木糖醇脱氢酶（XDH）的基因来源，构建出可以代谢木糖的重组酿酒酵母，但是这些重组菌株发酵木糖能力较弱［4-6］。木酮糖激酶（Xylulokinase，XK）在酿酒酵母体内负责催化木酮糖转化为5-磷酸木酮糖，处于木糖代谢物进入PPP途径的关键点，是促进木糖代谢向下游进行的关键酶。酿酒酵母本身具有该酶，但表达量小。研究表明，表达P.stipitis的XYL1、XYL2并同时超表达自身木酮糖激酶基因（XKS1），可以促进菌株发酵木糖［7，8］。虽然表达XYL1、XYL2和XKS1的重组酿酒酵母可利用木糖发酵，但大多数的木糖都被用来产生木糖醇，乙醇发酵效果并不十分理想［9，10］，无法满足工业化应用。

目前，国内外构建的重组酿酒酵母无法满足工业化应用的主要原因之一是XR和XDH的辅酶特异性不同，容易在代谢过程中由于辅酶因子不能及时转换，导致氧化还原不平衡造成副产物的积累，从而影响乙醇的转化效率。Eliasson［11］建立在动力学模型基础上的数据模拟显示，当XR/XDH/XK值为1∶（≧10）∶（≧4）时，木糖醇的积累最少，乙醇产量最多。因此通过改变启动子的强度，调节木糖代谢关键酶的表达水平，可达到增加乙醇产率，减少木糖醇积累的目的。Matsushika［12］建立了一系列含有由PGKp和ADHp启动子控制XYL1、XYL2和XKS1的整合质粒的重组工业酿酒酵母。将这3个基因均置于PGKp启动子下的MR-4重组菌的XR/XDH/ XK值最接近理想比值，为1∶9∶6，其最高乙醇浓度达到15.6 g/L，乙醇得率则达到0.34 g/g，木糖醇产率下降到0.04 g/g。这表明通过调整启动子的表达强度调控这3个基因的表达水平具有重要的实践意义。

本实验室前期已在工业菌株S. cerevisiaeY5中成功表达了来自休哈塔假丝酵母的木糖还原酶（XR）基因，来自热带假丝酵母的木糖醇脱氢酶（XDH）基因和来自Y5的木酮糖激酶（XK）基因，并建立了一套适用于Y5的转化体系。重组酿酒酵母在以3%葡萄糖和2%木糖为底物进行厌氧发酵时可在12 h内将葡萄糖消耗殆尽，但木糖利用率较低，最大乙醇产量11.01 g/L、木糖醇产量2.45 g/L［13］。

本研究将来自树干毕赤酵母（Pichia stipitis）的木糖还原酶基因XYL1和木糖醇脱氢酶基因XYL2，置于PGKp强启动子下，将来自酿酒酵母S. cerevisiaeY5的木酮糖激酶基因XKS1分别置于己糖激酶启动子（HXK2p）和其内源的木酮糖激酶启动子（XKS1p）下。拟将不同启动子控制下的基因XYL1、XYL2和XKS1导入到发酵性能良好的S.cerevisiaeY5中，以期能够更加高效稳定发酵葡萄糖和木糖产乙醇的重组酵母菌株的目标。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 大肠杆菌（Escherichia coli）Top-10、毕赤酵母（Pichia stipitisCBS 6054）、酿酒酵母S.cerevisiaeY5（实验室专利菌种，专利号：ZL2008-10222897.7）均为本实验室保存。质粒pDR195、PUC18以及YIp5-kanR也均由本实验室保存。克隆载体pEASY-T1 Simple购自北京全式金生物技术有限公司。

1.1.2 培养基和培养条件 大肠杆菌及转化子用 LB培养基培养，使用时可补加100 μg/mL氨卞青霉素作为选择培养基用于筛选转化子，37℃静止或摇瓶振荡培养。酵母菌用YPD培养基，30℃静止或摇瓶振荡培养。

1.1.3 酶、抗生素及试剂 试验所用限制性内切酶购自宝生物工程（大连）有限公司。分子生物学操作所用试剂盒、Taq DNA聚合酶为天根生化科技（北京）有限公司生产。氨苄抗生素与生化试剂购自北京鼎国生物技术有限责任公司，所用化学试剂为分析纯。引物及基因序列的测定均由上海英骏（Invietrogen）生物技术有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 整合载体YIp5-XRXDH的构建 分别以表达载体pDR195-PGK-xyl1和pDR195-PGK-xyl2为模板，PCR扩增XYL1和XYL2连同PGKp启动子和ADH终止子的表达原件X1、X2。再将X1、X2依次连入酵母整合载体YIp5-kanR，构建出重组酵母染色体整合质粒YIp5-XRXDH。

1.2.2 酵母表达载体pXKS1-H和pXKS1-X的构建 以S. cerevisiaeY5基因组为模板，PCR扩增HXK2p启动子、XKS1p启动子和木酮糖激酶基因XKS1。YIp5-KanR为模板扩增筛选标记KanR。将HXK2p启动子连同XKS1基因和ADH终止子的表达原件命名为X3-H；将XKS1p启动子连同XKS1基因和ADH终止子的表达原件命名为X3-X。将KanR、X3-H及X3-X连入PUC18载体中，分别获得pXKS1-H和pXKS1-X表达载体。所需引物序列及酶切位点见表1。

1.2.3 重组菌株S. cerevisiaeY5-X3-1与S. cerevisiaeY5-X3-2的构建 将整合质粒YIp5-XRXDH线性化后分别与表达载体pXKS1-H和pXKS1-X通过 LiAc完整细胞转化法共转化到S. cerevisiaeY5中，涂布于含G418的YPD培养基上，初步筛选转化子。采取两步筛选验证方法，首先随机挑取转化子，提取染色体基因组DNA，进行X1及X2片段的PCR扩增，筛选出YIp5-XRXDH整合成功的阳性转化子，进入第二步筛选；随后提取阳性转化子中质粒，进行X3片段的PCR扩增，进一步筛选出pXKS1-H或pXKS1-X转化成功的转化子，分别命名为S. cerevisiaeY5-X3-1和S. cerevisiaeY5-X3-2。

1.2.4 木糖还原酶（XR）、木糖醇脱氢酶（XDH）和木酮糖激酶（XK）酶活的测定 粗酶液的制备以及木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶的酶活测定完全参照文献［14］进行。用Coomassie Blue法［15］测定蛋白质含量。

1.2.5 重组菌S. cerevisiaeY5-X3-1与S. cerevisiaeY5-X3-2代谢混合糖产乙醇发酵试验 将待发酵的宿主菌S. cerevisiaeY5和重组菌S. cerevisiaeY5-X3-1、S. cerevisiaeY5-X3-2分别接种于100 mL YEPD液体培养基中，30℃，150 r/min活化24 h。然后换成新鲜的YEPD液体培养基，于同样条件下增殖培养24 h，测定其细胞含量（OD600值）。将培养得到的菌液离心，收集沉淀，用0.9% NaCL溶液洗涤沉淀两次，作为发酵种子液。

将S. cerevisiaeY5、S. cerevisiaeY5-X3-1，S. cerevisiaeY5-X3-2的种子液分别接种到50 mL 1.5%葡萄糖、5%木糖的混合糖培养基中，发酵条件为30℃，150 r/min。发酵起初每隔4 h取样一次，12 h后每隔12 h取样一次，取样量为1 mL，连续取样120 h。发酵样品分析葡萄糖、木糖、木糖醇、乙醇浓度。

1.2.6 发酵试验结果分析方法 糖浓度测定：采用Agilent 1260高效液相色谱仪，色谱柱Hi-plex H柱，柱温40℃，检测器为安捷伦示差检测器，流动相0.005 mol/L硫酸，流速 0.6 mL/min，进样量为5 μL。乙醇浓度测定：Agilent7890A气相色谱仪，色谱柱HJ-PEG-200M为 60 m×0.32 mm×0.5 μm，柱温为120℃，进样量为1 μL。

2 结果

2.1 重组酵母整合质粒YIp5-XRXDH构建

构建流程如（图1）所示，分别以pDR195-PGK-xyl1和pDR195-PGK-xyl2为模板，利用设计的引物进行PCR反应。PCR产物经电泳检测，发现在2 230 bp、2 250 bp处分别有明显条带（图2）。亚克隆产物测序结果表明，X1和X2与各自PCR模板的基因序列同源性、蛋白质同源性均达100%，克隆得到的基因X1和X2序列正确。

分别用SphI、NheI双酶切或EagI、SphI双酶切亚克隆产物，经琼脂糖凝胶电泳回收纯化获得X1、X2基因。将X1连接在YIp5-kanR的SphI与NheI位点，将X2连接在YIp5-kanR的EagI与SphI位点，构建出重组酵母染色体整合质粒YIp5-XRXDH。质粒单、双酶切验证结果正确（图3）。

2.2 酵母表达载体pXKS1-H和pXKS1-X的构建

构建流程如图1所示，以酿酒酵母Y5为模板扩增HXK2p、XKS1p和XKS1基因。以YIp5-kanR为模板扩增kanR筛选标记。分别用EcoR I、BamH I和SalI、NdeI双酶切pXKS1-H和pXKS1-X，分别切下2 540 bp/4 501 bp、1 702 bp/5 339 bp和2 706 bp/4513、1 702 bp/5 517 bp，质粒构建成功（图4）。

2.3 工业酿酒酵母S. cerevisiae Y5转化及转化子筛选

PCR验证转化子染色体基因组DNA及其质粒，结果显示，S. cerevisiaeY5-X3-1在2230 bp、2250 bp和2920 bp处分别有一个明显条带（图5-A）；同时提取S. cerevisiaeY5-X3-2的染色体基因组DNA及质粒pXKS1-X，PCR验证（图5-B）显示，S. cerevisiaeY5-X3-2在2230 bp、2250 bp和3086 bp处分别有一个明显条带。两株重组菌株均扩增得到大片段X1、X2、X3。亚克隆产物测序结果表明，X1、X2和X3与各自PCR模板的基因序列同源性、蛋白质同源性均达100%，克隆得到的基因X1、X2和X3序列正确。表明外源目的基因成功导入到酵母中。

2.4 重组酿酒酵母木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶酶活测定

分别测定宿主菌S. cerevisiaeY5及转化子S. cerevisieY5-X3-1与S. cerevisiaeY5-X3-2粗酶液中木糖还原酶（XR）、木糖醇脱氢酶（XDH）和木酮糖激酶（XK）的比活力水平，结果（表2）显示宿主菌株S. cerevi-siaeY5中基本没有木糖还原酶和木糖醇脱氢酶酶活，木酮糖激酶的酶活水平极低。转化子S. cerevisiaeY5-X3-1和S. cerevisiaeY5-X3-2的木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的比活力分别为宿主菌株的160倍和78倍。说明来源于P. stipitisCBS6054的木糖还原酶基因XYL1和木糖醇脱氢酶基因XYL2在宿主菌株S. cerevisiaeY5中得到了活性表达。此外，在Y5-X3-1菌株中，HXK2启动子控制下的XK显示出相应较高的酶活水平。

2.5 发酵生长曲线的测定

宿主菌和重组菌株的生长曲线（图6）显示在混合糖培养基中宿主菌S. cerevisiaeY5及重组菌的生长情况。宿主菌生长缓慢，在120 h测得其最大生长量。两株重组菌生长状况相似，且均明显优于宿主菌，说明异源基因XYL1和XYL2的插入未影响重组菌的生长。另外，S. cerevisiaeY5-X3-1的生长状况略优于S. cerevisiaeY5-X3-2。

2.6 代谢葡萄糖和木糖限氧共发酵试验

重组酵母菌S. cerevisiaeY5-X3-1、S. cerevisiaeY5-X3-2 阳性转化子及宿主菌S. cerevisiaeY5在限氧条件下进行葡萄糖木糖共发酵摇瓶试验。HPLC检测分析发酵底物的消耗和产物的生成（图7）。

重组菌在4 h内将葡萄糖消耗殆尽后开始利用木糖，且均在120 h内基本将木糖代谢完毕。将木酮糖激酶基因XKS1置于已糖激酶启动子（HXK2p）的重组菌Y5-X3-1在96 h处测得最大乙醇产量24.37 g/L（图7-B），而将此基因置于其内源启动子（XKS1p）的重组菌Y5-X3-2在96 h处测得最大乙醇产量为21.47 g/L（图7-C）。两株重组菌的乙醇产率分别达到理论值的76%和67%。宿主菌Y5在混合糖发酵初级阶段8 h处测得最大乙醇产量7.40g/L，同一时间点测其葡萄糖消耗完毕，故推断宿主菌Y5所产乙醇应全为葡萄糖发酵生成。由图（7-A）可以看出，宿主菌也能利用少量的木糖，并且产生约9.02 g/L木糖醇，一般认为在非特异性还原酶的作用下，酿酒酵母可以消耗少量的木糖。Y5-X3-1和Y5-X3-2的木糖消耗均为宿主菌的5倍，乙醇产量分别是宿主菌的3.3倍和2.9倍。由此说明，木糖代谢关键酶基因成功导入酿酒酵母Y5中，并得以成功表达，其木糖代谢上游途径已打通。

两株重组菌经120 h发酵，Y5-X3-1在乙醇得率方面较Y5-X3-2增加了16.1%，前者木糖醇最高浓度为10.47 g/L，后者为11.87 g/L，相比下降了13.3%（表3）。

3 讨论

国内外构建能利用木糖产乙醇的酿酒酵母普遍采用将天然利用木糖真菌中的XYL1与XYL2基因转入S. cerevisiae，重组菌株虽能利用木糖，但中间产物木糖醇大量积累，乙醇产量不高。分析原因主要是重组酿酒酵母中表达的XR和XDH所需的辅因子不平衡［16，17］。利用不同启动子对基因表达可以进行精细调控，使目的基因适度表达，减少由于过量表达引起的细胞内部负担。

用于大规模乙醇生产的菌株多为耐受乙醇和木质纤维素水解液中抑制物能力较强，染色体组为多倍体的工业酿酒酵母菌株［18-21］。二倍体絮凝菌株S. cerevisiaeY5能够耐受发酵过程中产生的较高浓度的抑制剂，具有良好的乙醇发酵性能［22，23］。本研究以S. cerevisiaeY5为宿主菌，在引入木糖代谢关键酶的同时过表达木酮糖激酶基因，并通过启动子的不同调节3个酶的酶活比例。

由于己糖激酶基因启动子（HXK2p）转录水平较XKS1基因自身启动子（XKS1p）较强［18］，因此两株重组菌酶活显示Y5-X3-1的木酮糖激酶酶活水平高于Y5-X3-2。对比两株重组菌，木酮糖激酶酶活较高的Y5-X3-1在混合糖培养基中的生长能力不及Y5-X3-2。Jin 等［19］认为表达过高水平的木酮糖激酶可能会降低细胞内的ATP 水平从而影响菌体的生长。

重组菌Y5-X3-1和Y5-X3-2的XR/XDH/XK比值分别约为1∶5∶4和1∶5∶2。其他相关研究结果表明，当重组菌的XR/XDH/XK比值为1∶（≧10）∶（≧4）时，木糖醇积累最少，乙醇产量最多［11］。Y5-X3-1的XR/XDH/XK比值与理论值最相近，乙醇产量最高。

4 结论

本文将来自树干毕赤酵母（P.stipitis）的木糖还原酶基因XYL1和木糖醇脱氢酶基因XYL2置于PGKp强启动子下,同时将来自酿酒酵母S. cerevisiaeY5的木酮糖激酶基因XKS1分别置于己糖激酶启动子（HXK2p）和其内源的木酮糖激酶启动子（XKS1p）下。通过启动子的调控，实现XR/XDH/XK三者比值达到1∶5∶4，接近1∶（≧10）∶（≧4）的最优比例，从而降低了副产物木糖醇的积累，提高了乙醇的产率，初步实现了构建更为高效稳定共代谢葡萄糖和木糖产乙醇重组酿酒菌株的目标。

［1］ 曹秀华, 阮奇城, 林海红, 等. 纤维燃料乙醇生产中木糖发酵的研究进展［J］. 中国麻业科学, 2010, 32（3）：166-182.

［2］ 谢丽萍, 王正祥, 诸葛健. 利用可再生资源生产酒精的细菌、酵母中的代谢工程［J］. 食品与发酵工业, 2002, 127（112）：63-68.

［3］ Jeffries TW, Jin YS. Metabolic engineering for improved fermentation of pentoses by yeasts［J］. Applied Microbiology and Biotechnology, 2004, 63（5）：495-509.

［4］ Guo T, Liang DF, Bao XM. Establishment and ethanol fermentation of a xylose metabolic pathway in an industrial strain of Saccharomyces cerevisiae［J］. Sugarcane and Canesugar, 2007, 3：26-29.

［5］ Johansson B. Hahn-Hägerdal B. The non-oxidative pentose phosphate pathway controls the fermentation rate of xylulose but not of xylose in Saccharomyces cerevisiae TMB3001［J］. FEMS Yeast Research, 2002, 2（3）：277-282.

［6］ Wahlbom CF, Zyl WH, Jönsson LJ, et al. Generation of the improved recombinant xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae TMB 3400 by random mutagenesis and physiological comparison with Pichia stipitis CBS 6054［J］. FEMS Yeast Res, 2003, 3（3）：319-326.

［7］ Johansson B, Christensson C, Hobley T, et al. Xylulokinase overexpression in two strains of Saccharomyces cerevisiae also expressing xylose reductase and xylitol dehydrogenase and its effect on fermentation of xylose and lignocellulosic hydrolysate［J］. Appl Environ Microbiol, 2001, 67（9）：4249-4255.

［8］ Wang Y, Shi WL, Liu XY, et al. Establishment of a xylose metabolic pathway in an industrial strain of Saccharomyces cerevisiae［J］. Biotechnology Letters, 2004, 26（11）：885-890.

［9］ Lee SH. Kodaki T, Park YC, et al. Effects of NADH-preferring xylose reductase expression on ethanol production from xylose in xylosemetabolizing recombinant Saccharomyces cerevisiae［J］. Journal of Biotechnology, 2012, 158（4）：184-191.

［10］ Katahira S, Mizuike A, Fukuda H, et al. Ethanol fermentation from lignocellulosic hydrolysate by a recombinant xylose- and cellooligosaccharide-assimilating yeast strain［J］. Applied Microbiology and Biotechnology, 2006, 72（6）：1136-1143.

［11］ Eliasson A, Hofmeyr J-HS, Pedler S, et al. The xylose reductase/ xylitol dehydrogenase/xylulokinase ratio affects product formation in recombinant xylose-utilising Saccharomyces cerevisiae［J］. Enzyme Microbial Technology, 2001, 29（4/5）：288-297.

［12］ Matsushika A, Sawayama S. Comparative study on a series of recombinant flocculent Saccharomyces cerevisiae strains with different expression levels of xylose reductase and xylulokinase［J］. Enzyme Microbi Technol, 2011, 48：466-471.

［13］ 张洁宁, 田沈, 杨秀山. 提高木糖代谢能力的酿酒酵母Y5-X3的初步构建［J］ . 可再生能源, 2012, 30（4）：47-51.

［14］ Matsushika A, Watanabe S, Kodaki T, et al. Expression of protein engineered NADP+-dependent xylitol dehydrogenase increases ethanol production from xylose in recombinantSaccharomyces cerevisiae［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 81（2）：243-255.

［15］ Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding［J］. Analy Biochem, 1976, 72（1/2）：248-254.

［16］ Steinmetz EJ, Warren CL, Kuehner JN, et al. Genome-wide distribution of yeast RNA polymerase II and its control by Sen1 helicase［J］. Molecular Cell, 2006, 24（5）：735-746.

［17］ Watanabe S, Salen AA, Pack SP, et al. Ethanol production from xylose by recombinant Saccharomyces cerevisiae expressing protein engineered NADP+-dependent xylitol dehydrogenase［J］. Journal of Biotechnology, 2007, 130（3）：316-319.

［18］ Peng BY, Shen Y, Li XW, et al. Improvement of xylose fermentation in respiratory-deficien xylose-fermenting Saccharomyces cerevisiae［J］. Metabolic Engineering, 2012, 14 （1）：9-18.

［19］ Xiong MY, Chen GH, Barford J, et al. Alteration of xylose reductase coenzyme preference to improve ethanol production by Saccharomyces cerevisiae from high xylose concentrations［J］. Bioresource Technology, 2011, 102 （19）：9206-9215.

［20］ Jin YS, Ni HY, Laplaza JM, et al. Optimal growth and ethanol production from xylose by recombinant Saccharomyces cerevisiae require moderate D-xylulokinase activity［J］. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69（1）：495-503.

［21］ Rizzi M, Harwart K, Erlemann P, et al. Purification and properties of the NAD+-xylitol-dehydrogenase from the yeastPichia stipitis［J］. Joural of Fermentatin Bioengineering, 1989, 67（1）：20-24.

［22］ Tian S, Zhu JY, Yang XS. Evaluation of an adapted inhibitortolerant yeast strain for ethanol production from combined hydrolysate of softwood［J］. Applied Energy, 2011, 88（5）：1792-1796.

［23］ Tian S, Yang XS, Zhu JY. Robust cellulosic ethanol production from SPORL-pretreated lodgepole pine using an adapted strain Saccharomyces cerevisiae without detoxification［J］. Bioresource Technology, 2010, 101（22）：8678-8685.

（责任编辑 李楠）

Construction of Recombinant Saccharomyces cerevisiae Strains Through Expressing the Key Genes in the Xylose Metabolism Under the Control of Different Promoters for Co-fermentation Glucose and Xylose

Jin Yi Wang Zhen Mo Chunling Yang XiuShan Tian Shen
（College of Life Science，Capital Normal University，Beijing 100048）

In order to obtain a recombinant yeast strain which can co-ferment both xylose and glucose, the key genes of enzymes in the xylose metabolism were cloned and transformed intoSaccharomyces. cerevisiaeY5. TheXYL1andXYL2genes fromPichia stipitisCBS6054 were placed under thePGKp, which is a constitutive strong promoter；endogenesisXKS1gene fromS.cerevisiaeY5 was controlled byHXK2pand the native promoterXKS1p, respectively. We measured the activity of XR、XDH and XK and evaluated the xylose-fermenting abilities of the engineered strains. The highest xylulokinase activity was observed in the strain Y5-X3-1 whoseXKS1was controlled byHXK2p. The activity of enzyme ratio was 1∶5∶4 between XR, XDH and XK. Furthermore, the xylose consumption ofS.cerevisiaeY5-X3-1 was 5 times as the host strain during co-fermentation, and the highest ethanol concentration was 24.35 g/L, which correspond to 73% of the theoretical value.

Saccharomyces cerevisiaeXylose Ethanol Co-fermentation Promoter

2013-08-28

北京市教育委员会科技计划重点项目（KZ201310028034），国家自然科学基金项目（31100578）

金怡，女，硕士研究生，研究方向：微生物酶和发酵工程；E-mail：jinyikele@163.com

田沈，博士，教授，研究方向：微生物与生物质能源转化；E-mail：cnu_tianshen@sina.com