王靖 朝格图 李蓓 王志钢
(内蒙古大学生命科学学院,呼和浩特 010021)
乙酰肝素酶及在肿瘤治疗中的应用
王靖 朝格图 李蓓 王志钢
(内蒙古大学生命科学学院,呼和浩特 010021)
乙酰肝素酶(Heparanase,Hpa)是哺乳动物体内唯一能够裂解硫酸乙酰肝素蛋白多糖的酶。通过破坏细胞外基质及基底膜结构的完整性,释放胞外基质上的各种生长因子,与肿瘤的转移、侵袭密切相关。目前的研究表明Hpa在大多数中晚期肿瘤中都有表达,尤其在恶性肿瘤中异常高表达,而Hpa表达的下调可以抑制肿瘤细胞的转移,可以作为一种抗肿瘤转移相关靶点用于中晚期肿瘤的治疗。综述了Hpa的结构与功能、对肿瘤转移的促进作用及在肿瘤治疗中的应用情况。
乙酰肝素酶 肿瘤转移 肿瘤治疗
硫酸乙酰肝素(Heparan Sulfate,HS)又称肝素,是胞外基质(Extracellular matrix,ECM)和基底膜(Basement membrane,BM)中的主要多糖组分之一[1,2]。HS是一种高度硫酸化的链状分子,一端固定于ECM或BM上,多个HS分子的侧链特异性位点可以同各种肝素结合分子的丝氨酸、甘氨酸残基共价连接形成硫酸肝素蛋白多糖(Heparan sulfate proteoglycans,HSPGs)[3,4],被固定的肝素结合分子具有相对稳定和局限化的特点,如β-成纤维细胞生长因子(β-fibroblast growth factor,β-FGF),血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF),角蛋白生长因子(Keratin growth factors, KGF),肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF),转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β),趋化因子(Chemotactic factor,CF)及蛋白酶(Protease)等。HSPGs是在细胞表面及ECM和BM广泛存在的特殊生物大分子,HSPGs组成网状结构,在ECM和BM上储存肝素结合分子并发挥其障碍功能[5]。HS不仅能在其侧链特异性位点结合大量的肝素结合分子并将其存储在ECM和BM上,还能通过水解侧链来调节肝素结合分子的生物活性、功能、作用方式等[6,7]。肝素结合分子的释放对靶细胞的生理功能起着重要的调节作用。
乙酰肝素酶又称类肝素酶,为内源性β-葡萄糖
醛酸酯酶,能识别硫酸乙酰肝素侧链的特异位点。通过水解HS侧链的糖苷键可将HS降解为10-20个糖单位的短糖链。Vlodasky等[8]于1999年首次分离到Hpa基因。
至今发现的人类Hpa基因有两种:Hpa1和Hpa2。Hpa1即为通常所说的乙酰肝素酶,Hpa1基因位于4q21.3,从血小板和胎盘中克隆得到,基因全长约39 kb,由14个外显子和13个内含子组成,中间序列高度保守,其cDNA全长1 629 bp,编码543个氨基酸残基组成的相对分子质量61.2 kD的多肽链。在Hpa1前体中,前导肽由35个氨基酸残基组成(前导肽,Met1-Ala35)。Hpa1前体转移到内质网后,6' N-糖基化位点处糖基化。在组织蛋白酶L的作用下,前体的Ser110-Gln157线性区域被切除,产生50 kD(Lys158-Ile543)和8 kD(Gln36-109)的两个亚基。这两个亚基非共价连接形成异源二聚体即为具有活性的Hpa,Glu225和 Glu343为其活性中心[9]。Hpa2基因位于10q23-24,由乳腺组织的cDNA中克隆得到,与Hpa1基因的同源性为35%。Hpa2基因转录后可被剪接成3种不同的mRNA,分别编码含592、534和480个氨基酸残基的多肽,但这3种多肽均为胞内结合蛋白,没有降解HS的活性。
在人正常组织中,Hpa主要分布在角质细胞、胎盘和脾脏、淋巴结、胸腺等免疫组织细胞,其他非免疫组织中不表达,但几乎在人类所有恶性肿瘤中Hpa有较高水平表达,尤其在一些侵袭转移性强的恶性肿瘤中表达水平更高[10]。此外,Hpa还参与增生性病变、炎症发生、损伤性修复、伤口愈合、免疫反应、胚胎形成等多种病理、生理过程。Hpa的生理活性与环境pH密切相关[11],在pH4.0-7.5的环境中有活性,最佳活性pH在5.5-5.8,大于8.0则会失活。随着局部环境pH值的变化,Hpa既可以为酶,也可以为黏附分子。在酸性条件下,Hpa以酶的形式发挥作用,降解HSPGs中的HS侧链;当pH值高于7.0时,Hpa表现为黏附活性,与HS结合。在生理状态pH条件下,Hpa以无活性状态连接到ECM或细胞表面,当pH下降时则变的有活性并且裂解它连接的HSPGs。
HSPGs降解则可释放结合在HS侧链上的生长因子、趋化因子和蛋白酶等活性物质,产生一系列生物学效应:(1)降解ECM和BM。破坏了细胞转移的屏障,降解HSPGs产生的HS片段可激活HS受体CD44v3,发出细胞内迁移信号,促使细胞变形、运动;(2)释放结合在HS上的生长因子(VEGF、FGF等)。导致细胞和新血管的增生,同时组织特异性生长因子的释放能驱动细胞呈器官选择性游动;(3)降解正常组织屏障中的HSPGs。有利于肿瘤细胞游出,单独或协同VEGF促进肿瘤微血管的生成,促进细胞的侵袭及转移[10];(4)调节胚泡滋养层细胞。通过裂解肝素及肝素结合蛋白的2-O-硫基团清除子宫内膜局部的黏液糖蛋白,使胚泡更容易粘附和植入子宫内膜;(5)通过水解肝素侧链,释放出各种肝素结合分子。促进滋养细胞侵入血管基底膜,使新生血管形成,为胚胎组织生长发育奠定基础;(6)释放HSPGs,促进毛囊干细胞的生长、分化和迁移,进而促进哺乳动物毛发生长。
ECM、BM是细胞和组织的天然屏障,也为细胞的生长迁移、分化和生存提供支架,肿瘤细胞必须突破ECM和血管基底膜才能侵染周围组织或者转移到其他器官。HS作为ECM的主要成分之一,在细胞黏附和运动等方面起着关键作用,肿瘤细胞的转移潜能与HS降解程度密切相关,Hpa的活性同肿瘤的转移有密切关系。早期研究显示B16黑色素瘤细胞和T淋巴瘤中发现Hpa活性升高[12],肿瘤愈后患者的肝素水平要远远高于正常组织[13],意味着Hpa在愈后患者的体内依旧是高表达的。Hpa基因的过表达不仅能够促进细胞迁移,而且还能加速肿瘤生长所必须的血管网的生长来促进恶性肿瘤细胞的生长[14]。Doweck等[15]对头颈部鳞状癌细胞的标本进行Hpa免疫组织化学分析发现,Hpa染色的程度和肿瘤分化程度呈正相关,与肿瘤的预后呈负相关。Nobuhisa等[16]对结肠癌细胞进行RT-PCR研究显示,Hpa的mRNA在癌细胞中的转录要远远高于正常组织,mRNA的高表达还与肿瘤组织血管生成、淋巴管侵袭及病人的生存期有关。各种肝素结合分子通过HS结合并储存在ECM上,当HS被降解时
这些生长因子和细胞因子便被释放,组织特异性生长因子的局部释放和活化为原发肿瘤的生长及转移创造了良好条件。
作为一种可以降解ECM和BM上的HSPGs的酶,Hpa与恶性肿瘤转移密切相关,这一特性为基于Hpa为靶点的肿瘤治疗,特别是抑制肿瘤转移开辟了新途径,在临床上具有重要意义。目前主要围绕两个方面开展工作,一是发现能致Hpa降解或失活的抑制剂,从而保护HSPGs;二是抑制Hpa的表达。
5.1 糖抑制剂PI-88
PI-88即磷酸甘露戊糖硫酸脂(Pentose phosphate mannose sulphate,PI-88)是高度硫酸化的甘露聚糖寡聚糖的混合物,其α1,3-糖苷五糖以及α1,2-糖苷四糖组成部分生物活性最强,是Hpa抑制物的有效组分。多种肝素衍生物的研究发现,硫酸化程度越高,对Hpa抑制效果越好。PI-88能够抑制约50%高度侵入性的大鼠乳腺腺癌原发肿瘤的生长及减少30%的肿瘤血管形成。临床试验中PI-88表现出强效的抗血管生成活性[17]。作为一种单一疗法或与其他标准化疗合用治疗非小细胞肺癌、肝细胞癌、前列腺癌Hpa的抑制物,PI-88已经完成Ⅰ期临床试验。PI-88抑制了Hpa的活性,干扰了与硫酸肝素结合的生长因子的释放,从而抑制了肿瘤细胞的转移和肿瘤细胞周围血管的形成[18]。PI-88有可能成为第1个应用于临床抗肿瘤治疗的Hpa抑制剂。
5.2 肝素
肝素,尤其是低分子量肝素能提高晚期肿瘤患者的生存几率。低分子量肝素通过抑制血液的凝固、抑制血小板和细胞之间的黏附,进而干扰原发性肿瘤细胞的转移。4种不同类型的低分子肝素在6个随机对照试验中,都能够增加癌症晚期患者的生存率[19],直接影响肿瘤细胞的生长和迁移。但肝素会抑制血液的凝固,还能促进ECM中贮存的各种细胞因子、生长因子(如bFGF、VEGF等)、趋化因子的释放,从而引起一系列的负性效应,普通肝素由于其强大的抗凝血活性限制它作为抗肿瘤转移剂的使用。非抗凝肝素因为它们可以高剂量给药,从而充分利用肝素的抗转移功能,还适用于癌症患者的出血并发症,因此具有很大的临床应用潜力,但其作用机制尚不完全清楚。一种可能是这种外源性肝素与HSPGs上的内源性肝素竞争Hpa,从而抑制了Hpa活性;另一种可能是通过阻断血小板的肿瘤细胞之间的相互作用,从而抑制肿瘤细胞的聚集体的形成。非抗凝肝素和相关化合物作为一个有前途的抑制癌细胞转移治疗策略。
5.3 PG545
PG545是一种人工合成的硫酸乙酰肝素类似物。一方面PG545可以螯合结合在ECM的VEGF,抑制肿瘤血管生成;另一方面可以通过抑制Hpa的活性,抑制VEGF、FGF-1、FGF-2的释放并干扰这些生长因子的转移。Dredge等[20]的大鼠试验表明,皮下注入PG545能够抑制20%-30%血管的生成;同时在体内诱发的乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、结肠癌、头颈部癌和黑色素瘤的小鼠模型中也具有抗肿瘤或抗转移效果。在4T1乳腺癌模型中,PG545以剂量依赖的方式显著抑制原发性肿瘤的转移。免疫组化检测显示,与正常小鼠肺组织相比,所有4T1乳腺肿瘤和肺组织,Hpa表达高出36%-43%,而经PG545处理后,则显著降低[21]。硫酸乙酰肝素类似物PG545能够明显抑制Hpa的活性,血管生成和肿瘤的发生、转移[22]。PG545有望成为一种新的临床抗癌药物。
5.4 多肽类
Levy-Adam等[23]的研究发现Hpa上有3个HS结合结构域,其中1个结构域(Lys158-Asn171)结合在Hpa的50 kD亚基的N末端。核磁共振(NMR)滴定试验证实HS结合在Hpa氨基酸残基Lys158-Asn162。结合在Lys158-Asn162区域的的1个短肽(KKDC)在剂量敏感的人群中能抑制Hpa的活性。此外,特异结合到Lys158-Asn162部位的中和抗体能抑制Hpa的活性,删除这一区域,Hpa不表现出酶活性。删除第2个HS结合结构域序列(Gln270-Lys280)产生了一个处于非活动状态的酶,不能与细胞表面的HS结合。第3个HS结合结构域位于Hpa的50 kD亚基的N末端Lys411-Arg432。此区域的抗体抑制Hpa的活性,缺乏此区域不表现出酶活性。试验表明,Lys158-Asn171比其他两个结构域与HS结合更加强
烈[24]。因此,开发Lys158-Asn171识别域的Hpa抑制剂,可以作为一种治疗恶性肿瘤的有效方法。
5.5 苏拉明
苏拉明(Suramin)是一种多磺酸萘脲,与HSPG中HS侧链相似,具有抗增生活性,可以抑制各种生长因子与其细胞表面受体结合,通过非竞争性抑制作用抑制Hpa活性。体外试验中,使用苏拉明类似物(NF-127、NF-145和NF-171)分别处理高度侵袭性和脑转移性黑色素瘤(70 W)细胞均发现Hpa的表达受到有效抑制并呈现出剂量依赖性。使用涂有Hpa的滤膜和人工基底膜进行化学侵袭的研究表明苏拉明类似物能够显著降低人70 W细胞的侵袭能力;体内血管生成试验表明苏拉明类似物能够抑制Hpa导致的血管生成[25]。
5.6 硫酸昆布多糖
硫酸昆布多糖(Laminarin sulphate,LAMS)是一种含硫酸基的多糖,由昆布多糖在人工条件下硫酸化得到。LAMS有多方面的生物活性,包括抗肿瘤、调节免疫功能、调节血脂、降血糖、抗凝血等作用。LAMS可直接杀伤肿瘤细胞、抑制血管生成、诱导细胞凋亡及调节机体免疫的功能,具有抗肿瘤及抑制肿瘤细胞生长扩散的作用。另外,昆布多糖硫酸酯能够干扰bFGF血管生成信号刺激作用,致使肿瘤组织的血管生成受阻,进而抑制肿瘤生长。体外试验表明可以有效抑制Hpa对HSPG的降解。给小鼠皮下注射LAMS后再静脉注入黑素瘤细胞或乳腺癌细胞,发现对肺扩散转移的抑制率达80%-90%[26]。
5.7 RNAi
RNAi能够高特异性地使基因转录后沉默,因此广泛应用于抗肿瘤、病毒、心血管等疾病的研究。通过RNA干扰技术(RNAi)在转录后水平阻止Hpa基因的表达,可以抑制肿瘤细胞的侵润和转移,为临床预防肿瘤细胞的侵润和转移提供了条件,并为治疗肿瘤带来了希望。Liu等[27]构建了靶向Hpa基因的包含短发夹RNA(Short hairpin RNAs,shRNA序列)和基于HpamiR30的shRNA的慢病毒载体,体内和体外条件下分别转染人类恶性黑色素瘤A375,结果显示转染72 h后Hpa表达量下降50%-60%,可以抑制A375黑色素瘤细胞在体外增殖、黏附、迁移和侵袭。因此,进一步研究Hpa加工的具体过程、控制其表达和活性的调控因子对找到攻克肿瘤的突破点具有重要意义。
Hpa作为哺乳动物体内唯一能够裂解硫酸乙酰肝素蛋白多糖的酶,与肿瘤生长、侵润、转移密切相关,已经受到人们越来越多的关注。但还有很多问题亟待解决,包括Hpa在肿瘤细胞中高表达的机制;Hpa在肿瘤细胞中的活性远远高于正常组织的原因;在肿瘤细胞转移过程中,除了Hpa有没有其他物质共同参与等等。另外,目前以Hpa为靶位点的多种抑制剂均有一定的副作用,因此有必要对其各种潜在风险进行仔细评估。此后的研究重点可能会集中在Hpa对促进不同组织和细胞肿瘤转移的细胞生物学机制及Hpa的表达、活性调节方面。以Hpa为靶位点抗肿瘤药物,包括低分子量肝素、PI-88及肝素类似物的临床应用也会成为今后研究的热点。随着对以Hpa为靶位点抗肿瘤药物的进一步筛选,将为明确肿瘤发生、转移的机制提供支持。
[1] Kjellen L, Lindahl U. Proteoglycans:structures and interactions[J]. Annu Rev Biochem, 1991, 60:443-475.
[2] Iozzo RV. Matrix proteoglycans:from molecular design to cellular function[J]. Annu Rev Biochem, 1998, 67:609-652.
[3] Capila I, Linhardt RJ. Heparin-protein interactions[J]. Angew Chem Int Ed Engl, 2002, 41:391-412.
[4] Lindahl U, Li JP. Interactions between heparan sulfate and proteinsdesign and functional implications[J]. Int Rev Cell Mol Biol, 2009, 276:105-159.
[5] Vlodavsky I, Friedmann Y. Molecular properties and involvement of heparanase in cancer metastasis and angiogenesis[J]. J Clin Invest, 2001, 108:341-347.
[6] Gray E, Mulloy B, Barrowcliffe TW. Heparin and low molecularweight heparin[J]. Thromb Haemost, 2008, 99:807-818.
[7] Lindahl U. Heparan sulfate-protein interactions-a concept for drug design[J]. Thromb Haemost, 2007, 98:109-115.
[8] Voldavsky I, Friedmann Y, Elkin M, et al. Cloning of heparanase:
gene cloning, expression and function in tumor progression and metastasis[J]. Nat Med, 1999, 5:793.
[9] Xu X, Ding J, Rao G, et al. Estradiol induces heparanase-1 expression and heparan sulphate proteoglycan degradation in human endometrium[J]. Hum Reprod, 2007, 22:927-937.
[10] Fux L, Ilan N, Sanderson RD, et al. Heparanase:busy at the cell surface[J]. Trends Biochem Sci, 2009, 34:511-519.
[11] Vreys V, David G. Mammalian heparanase:what is the message?[J]. Cell Mol Med, 2007, 11:427-452.
[12] Vlodavsky I, Beckhove P, Lerner I, et al. Significance of heparanase in cancer and inflammation[J]. Cancer Microenviron, 2012, 5:115-132.
[13] Lazo-Langner A, Goss GD, Spaans JN, et al. The effect of low-molecular-weight heparin on cancer survival[J]. Thromb Haemost, 2007, 5:729-737.
[14] Lerner I, Baraz L, Pikarsky E, et al. Function of heparanase in prostate tumorigenesis:potential for therapy[J]. Clin Cancer Res, 2008, 14:668-676.
[15] Doweck I, Kaplan-Cohen V, Naroditsky I, et al. Heparanase localization and expression by head and neck cancer:correlation with tumor progression and patient surrival[J]. Neoplasia, 2006, 8:1055-1061.
[16] Nobuhisia T, Naomoto Y, Ohkawa T, et al. Heparanase expression correlates with malignant potential in human colon cancer[J]. Cancer Res Clin Oncol, 2005, 131:229-237.
[17] Raman K, Karuturi R, Swarup VP, et al. Discovery of novel sulfonated small molecules that inhibit vascular tube formation[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2012, 22:4467-4470.
[18] Ilan N, Elkin M, Vlodavsky I. Regulation, function and clinical significance of heparanase in cancer metastasis and angiogenesis[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2006, 38:2018-2039.
[19] Borsig L, Wong R, Feramisco J, et al. Heparin and cancer revisited:mechanistic connections involving platelets, P-selectin, carcinoma mucins, and tumor metastasis[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98:3335-3357.
[20] Dredge K, Hammond E, Handley P, et al. PG545, a dual heparanase and angiogenesis inhibitor, induces potent anti-tumour and antimetastatic efficacy in preclinical models[J]. British Journal of Cancer, 2011, 104:635-642.
[21] Hammond E, Brandt R, Dredge K. PG545, a heparan sulfate mimetic, reduces heparanase expressionin vivo, blocks spontaneous metastases and enhances overall survival in the 4T1 breast carcinoma model[J]. PLoS One, 2012, 7:1-11.
[22] Dredge K, Hammond E, Davis K, et al. The PG500 series:novel heparan sulfate mimetics as potent angiogenesis and heparanase inhibitors for cancer therapy[J]. Invest New Drugs, 2010, 28:276-283.
[23] Levy-Adam F, Abboud-Jarrous G, Guerrini M, et al. Identification and characterization of heparin /heparan sulfate binding domains of the endoglycosidase heparanase[J]. J Biol Chem, 2005, 280:20457-20466.
[24] Zetser A, Levy-Adam F, Kaplan V, et al. Processing and activation of latent heparanase occurs in lysosomes[J]. J Cell Sci, 2004, 117:2249-2258.
[25] Marchetti D, Reiland J, Erwin B, et al. Inhibition of heparanase activity and heparanase-induced angiogenesis by suramin analogues[J]. Int J Cancer, 2003, 104:167-174.
[26] Miao HQ, Elkin M, Aingorn E, et al. Inhibition of heparanase activity and tumor metastasis by laminarin sulfate and synthetic phosphorothioate oligo deoxynucleo tides[J]. Int J Cancer, 1999, 83:424-431.
[27] Liu XY, Tang QS, Chen HC, et al. Lentiviral miR30-based RNA interference against heparanase suppresses melanoma metastasis with lower liver and lung toxicity[J]. Int J Bio Sci, 2013, 9:564-577.
(责任编辑 狄艳红)
Heparanase and Its Applications in Cancer Therapy
Wang Jing Chao Ge Tu Li Bei Wang Zhigang
(College of Life Science,Inner Mongolia University,Hohhot 010021)
Heparanase(Hpa)is the only endo-glycosidase which cleaves heparan sulfate(HS)in mammalian. The enzyme also can disrupt the integrity of the extracellular matrix(ECM)and basement membrane(BM), to release various growth factors from the ECM. Hpa is associated with migration and invasion of cancer cells. Recently, a series of studies have indicated that Hpa was expressed in most advanced cancers, especially in malignant cancer, while decreased expression of Hpa is helpful to inhibit the migration of cancer cells. Heparanase can be used as a potential therapeutic target for cancers. This paper reviews the structure and functions of Hpa, its role in promoting cancer metastasis and the application in cancer therapy.
Heparanase Cancer migration Cancer therapy
2013-11-17
国家自然科学基金项目(31160469,31360561)
王靖,女,硕士研究生,研究方向:基因工程;E-mail:wangjing.8909@163.com
王志钢,男,教授,研究方向:哺乳动物生殖生物学与生物技术;E-mail:lswzg@imu.edu.cn